癌細胞與人類醫學檢測競賽，如何應用液態活檢突破檢測困境？

液態生物檢體 / 液態活檢 (liquid biopsy) 曾被 MIT Technology Review 評選為 2015 年的十大突破性科技，透過採集血液、唾液、尿液等體液檢體，檢測受試者體內的特定生物標記，可作為非侵入式產前檢測（NIPT）、疾病早期篩檢、伴隨診斷、動態監控、癌症復發預測與預後評估等多種用途。具有方便、即時且低侵入性的優點，比起傳統侵入式採樣，更能提高受試者的接受度，近年相關研究與應用越發廣泛、應用於臨床檢測分析勢不可擋。

液態活檢提供癌症診斷與監控新方向
液態檢體應用的三大方向為：循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)、循環血液核酸（cell free DNA, cfDNA）以及胞外體或細胞外囊泡 (circulating exosomes 或 extracellular vesicles)。其中，又以 CTCs 和 cfDNA的應用較為成熟，CTCs 純化技術最早出現 (1990 年出現)，而 cfDNA/ctDNA 的臨床應用則是到 2007–2008 年次世代基因定序技術（new generation sequencing, NGS）問世後開始突飛猛進。隨著 NGS 技術的進步，以液態活檢代替實體腫瘤切片，已是近年來癌症臨床應用的熱門趨勢。傳統的腫瘤組織活檢（tissue biopsy）透過針吸或手術採集樣品，為侵入式的檢驗，對患者而言，不僅檢測風險高、體力消耗大，且會因採樣部位的不同而有差異，進而導致治療評估失準、影響預後等問題。而液態活檢僅需提供病患的體液作為檢體，為非侵入性或低侵入性採樣，可降低對病患的傷害、提高方便性、降低採樣成本，為無法進行組織切片的病患（例如身體狀況不適合開刀、腫瘤位於腦部、血管等採樣有安全疑慮區域等）提供另一項新選擇。

臨床上，液態活檢多採用即時聚合酶鏈鎖反應（real-time PCR, RT-PCR）或微滴式數字聚合酶鏈鎖反應（digital droplet PCR, ddPCR）等技術進行檢測。兩者皆是使用已知的變異位點來設計探針，偵測檢體中的突變位，作為醫師評估、診斷與開立處方的參考依據。RT-PCR可即時在電腦監測實驗結果、大幅縮短檢測時間。而 ddPCR 則能精確地測定核酸的DNA分子個數，相較其他檢測僅能相對定量，ddPCR 能做到絕對定量的準度。然而，探針的設計無法包含所有基因變異的圖譜，因此可能缺少較不常見的臨床相關突變鑑定力，同時也限制了對其他新興生物標記的檢測。若改由 NGS 方式進行檢測，則可更全面、完整的綜觀整體變異。

檢測極微量 ctDNA，選對工具很重要！
1940年代，科學家從血液中發現了cfDNA 的存在，正常細胞在體內代謝更替、破裂時，會釋放出所有胞內物質，DNA也由細胞內游離進入血液中，成為 cfDNA。一般來說，這類游離出來的 DNA 會被巨噬細胞清除，然而，當游離 DNA 的生成速度大過清除率時，則有可能持續存在於血液中，比如來自腫瘤細胞的 DNA。而 cfDNA 中確實也帶有腫瘤細胞凋亡後釋出的循環腫瘤核酸（circulating tumorDNA, ctDNA），因此透過血液檢測 ctDNA，即可追蹤癌細胞存在與否，且檢測 ctDNA的變異，亦可作為腫瘤診斷、對症下藥的參考依據。此外，循環 DNA 的半衰期短，因此 ctDNA 的組成也會隨著腫瘤進展而改變，可即時、準確且敏感的呈現腫瘤消失、擴散與復發等狀態。儘管利用液態活檢輔助癌症診療是醫療檢驗上的一大突破，卻仍舊面臨許多挑戰，比如：
一、腫瘤異質性（tumor heterogeneity）：因癌細胞異質性高，游離出來的部分 DNA 並無法代表所有細胞特性、描繪出腫瘤的全貌，因此在檢測結果上的判讀必須更謹慎保守。
二、技術的純化與靈敏度問題：早期腫瘤釋出的 ctDNA 量更低，除非檢測技術在純化與靈敏度上有更進一步的突破，否則較難應用於早期腫瘤的偵測。

如何提高檢測精確度？正確採樣與樣本 QC 為關鍵！
由於 ctDNA 的量極少，在血液中約只佔 cfDNA 的百萬分之一，因此在檢測過程中，純化與偵測的靈敏度，便成為其中的關鍵。本文從 cfDNA 應用於檢測所需經過的四大步驟：取樣、純化、偵測、分析，分別簡介各步驟及在品管 (QC) 上的注意事項：
一、取樣及保存（sampling / preservation）：液態活檢的取樣為低侵入性，具有方便、即時之優點。但在保存上因 cfDNA 半衰期短，且在採樣、運輸、保存過程亦可能導致有核細胞破裂、釋放出 genomic DNA，干擾後續檢驗的精準度，而使用專門的保存管，則可有效降低 cfDNA 的降解、維持其他細胞完整性、提高保存品質。
二、純化（purification）：由於 ctDNA 含量少，純化更需下功夫。一般市面上的純化產品，可依純化方法區分為磁珠法（magnetic beads）或膜柱法（silica membrane）。磁珠法的原理為提供適當環境，讓 DNA 吸附到羧基修飾的高分子磁珠表面，藉此方式收集 DNA，並在後續用洗脫的方式讓 DNA 與磁珠脫離，達到純化的目的。膜柱法則是使用含矽濾膜作為核酸的特異性吸附材料，透過鹽類及pH值的調整改變濾膜對核酸的吸附能力。兩者間的差異主要在於回收率。在純化一般 DNA 時差異不大，然而因為 ctDNA 極度微量，因此與磁珠碰撞結合機率低，膜柱法則如同網魚般能夠一網打盡，較佔優勢。
三、偵測（detection）: 純化後的 ctDNA 可依檢測需求，搭配 microarray、PCR、qPCR、ddPCR、NGS 等方式偵測。在上機前，樣本的 QC 也是確保檢測準確度的一大關鍵，母親的血液中可能帶有來自胎盤的胎兒 DNA，中風或是心臟病患者的血液中也可能帶有DNA片段，除樣本基本濃度測定外，使用高靈敏性的毛細管電泳技術(capillary electrophoresis, CE) ，例如： BiOptic Inc. 的 Qsep 系列、Advanced Analytical Fragment Analyzer 或Agilent Bioanalyzer，確認樣本片段的大小（一般 ctDNA大小應落於160~200bp之間），可以排除 genomic DNA或 carrier RNA 污染的可能性。
四、分析（analysis）：爾後再進行數據分析，將其利用於醫療診斷、輔助上。

『工欲善其事，必先利其器』，選對武器與工具，在對抗疾病等無形的敵人，才能更佔優勢。液態活檢是邁向臨床精準醫學的重要一步，也為癌症醫療帶來革命性的轉變，不僅用於伴隨診斷、動態監控，更可追蹤癌症復發與預後。疾病變化萬千，醫學界也期待能有更多抗衡疾病的武器，因此單就檢測疾病存在與否已不能滿足醫療所需。科學家正嘗試將 ctDNA 與蛋白質標記做連結，試圖透過此方法將液態活檢的檢測結果回溯癌症發生位置、或是利用液態活檢分辨哪些癌症需要即時處理、哪些則否。期待未來，有意義的液態活檢應能比傳統檢測更精準、全面、靈敏。應能在無症狀的人群中檢出早期癌症病患、同時亦能確認癌症發生位置以及是否需要治療。善用工具、靈活運用技術，將能為患者帶來更多益處。

撰文 / Alma Wu
審稿 / Thomas Huang、 Jane Lee