次世代定序 (next-generation sequencing, 簡稱 NGS) 相當為人所熟知的兩大應用，為非侵入性產前檢測 (NIPT) 和癌症基因檢測，但其實特殊單基因疾病（single gene disease 或稱 Mendelian disease）也是非常受重視的領域，而 NGS 在特殊疾病的基因檢測及應用一直都是台大醫院基因醫學部的主軸之一，因此我們拜訪了任職於台大醫院基因醫學部陳沛隆醫師。陳醫師為遺傳學家、內分泌科醫師，也是台大基因體暨蛋白體醫學研究所的副教授，長期致力找出各種人類疾病的致病基因，過去從使用連鎖分析及全基因體相關研究，到後來接觸 NGS，並專注於該技術之臨床應用，希望找出致病基因後，對基因診斷、遺傳諮詢、治療方式之選擇以及疾病病理生理機轉都能有更深入地了解，造福更多病患。此次訪談，陳醫師和我們分享了 NGS 在遺傳學與基因醫學上的重大貢獻，以及對於臨床上的困難與挑戰提出可行的解決方案。
您是如何踏入醫學遺傳學的領域，從事次世代定序 NGS 的應用?
答：我擔任台大醫院內分泌科總醫師，並且就讀台大醫學院臨床醫學研究所碩士班時，試圖找出葛瑞夫茲氏病（Graves’ disease）的致病基因，因而踏入遺傳學研究的領域，於美國約翰霍普金斯大學攻讀人類遺傳學博士時，更決定結合遺傳學與臨床醫學的專長作為一生研究與服務的主軸。在遺傳學研究上，1990 年代到 2000 年初，尋找致病基因的方法為連鎖分析（linkage analysis），從帶有特定遺傳疾病的家族（如安潔莉娜·裘莉的家族具有早發性的家族性乳癌/卵巢癌）著手，但僅限於單基因疾病（single gene disease）或稱為孟德爾遺傳疾病（Mendelian diseases）。到 2005 年，全基因體相關研究（Genome-wide association study, GWAS）問世，主要針對複雜性疾病（complex disease），即數十到數百個基因因素並合併環境因子所共同造成的疾病如糖尿病、肥胖、精神分裂症等。NGS 也在此時萌芽，2005 年第一篇 NGS 相關論文發表，2006-2007 年開始在研究上以及臨床應用上有所發展，接著下來的幾年內出現以 NGS 尋找致病基因的浪潮，而我也在 2009 年以後正式利用 NGS 進行學術研究以及臨床應用。
從 2010 年開始，我們便和耳鼻喉科的許權振教授和吳振吉醫師合作，將 NGS 應用於耳聾研究和治療。2013 至 2015 年台大醫院交付基因醫學部一項重要任務，要規劃並執行『A1 計畫（新時代遺傳基因醫學中心）』，設立 NGS 的臨床服務與學術研究的實驗室。一開始便建立結節硬化症（Tuberous sclerosis complex , TSC）、家族性乳癌（Familial breast cancer）及家族性大腸直腸癌（Familial colorectal cancer）的基因檢測。後來更逐漸拓展到先天性聽損（Congenital hearing impairment）、帕金森氏症（Parkinson’s disease）、早發性失智症（Dementia of early onset）、 多囊性腎臟病（Polycystic kidney disease, PKD）、視網膜色素病變（Retinitis pigmentosa, RP）、單基因黃疸（Single-gene jaundice）、粒線體疾病（Mitochondrial disease）、嗜鉻細胞瘤及副神經節瘤（Pheochromocytoma and paraganglioma）、遺傳性心律不整（Hereditary arrhythmia）等多種疾病。目的是將這些疾病的眾多基因，建立為臨床基因檢測，有助於病人之確定診斷及遺傳諮詢，也可能找到適合病人之精準醫療。
精準醫療好貴? 病人沒錢怎麼辦?
通常，單基因疾病是用傳統的桑格定序（Sanger sequencing）來做，這樣的檢測方式的成本受到需要檢測的基因的數目以及大小影響很大，平均估算起來大約一個基因收費一萬元。但以耳聾來說，有 80 個可能的致病基因就要台幣 80 萬，對病患來說負擔太重。此外，人類大約有超過兩萬個基因，所謂的全表現子定序（whole exome sequencing, WES）就是對兩萬個基因的編碼區域（coding region）全部定序，但如果有興趣的基因只有 200 個，僅佔人類整體基因的 1/100，卻用 WES 來看所有的基因，其實是浪費了百分之九十九的定序結果，殊為可惜。所以，台大醫院的基因檢測 panel（disease gene panel）也就應運而生，使分析更有效率，甚至連內含子（Intron，即 DNA 中非編碼之片段）、非轉譯區（untranslated region, UTR）這些 WES 無法檢測到的都包含在內。舉例來說，針對先天性聽損目前已知的 160 個可能單基因致病基因，我們目前利用次世代定序基因檢測 panel 來做基因診斷，收費可壓制在三萬元，比起傳統方式或 WES 方式在花費上都減低很多，但檢出率反而更高。此外，耳聾的終極治療方式─人工電子耳，裝置過程須耗費台幣一百萬，雖然對多數人都有效果，但有些人卻沒有改善，透過台大醫院和長庚醫院的合作，我們分析患者在該次世代定序基因檢測 panel得到的基因型，從中發現兩個特別的基因，會使人工電子耳治療的效果顯著不良。這是全世界最領先的發現。未來如果能根據這樣的基因型鑒定結果來決定人工電子耳治療的選擇，可謂精準醫療、個人化醫療的良好例證。
延伸閱讀：後 NGS 時代的生技浪潮NGS 應用不只是 NIPT 與癌症 特殊單基因疾病也是重點
不少人提到 NGS 的臨床應用時，都先想到 NIPT 或癌症，但特殊疾病是我們的主軸。單基因疾病的罹病機率通常落於千分之一到萬分之一之間，雖然以個別疾病來看，比例似乎不高，但就全台灣（或全世界）來看，個別疾病的總病人數就相當多，再乘以各種類的疾病數目，則整體來說罹患有特殊單基因疾病的患者及家族史是相當多的，也就是『有市場』的。很多單基因疾病的病人希望得到基因診斷、諮詢或治療建議，最近邁入 NGS 時代，相較於台灣其他診所主戰場皆在 NIPT、PGS 或 PGD，我們的實驗室主要還是投入在單基因疾病的部分，希望幫助更多這類疾病的患者與家屬。
台大醫院 陳沛隆醫師
這些基因檢測做完，後續的配套措施為何?
答：如同我們一直談到的，這樣的基因檢測服務可幫助達到基因診斷、遺傳諮詢或治療建議。例如不少罕見疾病登錄或重大傷病卡申請，都需要確實的基因診斷，才能符合規定進行申請。就遺傳諮詢的角度，透過有經驗的基因醫學醫師或遺傳諮詢師，可針對家族譜系建議哪些家族成員需接受基因檢測、哪些成員不用擔心、哪些臨床上無症狀的家屬可能帶有致病變異點等訊息。而且如果未來要懷孕生子，而家族內的致病變異點已透過次世代定序檢測而確定知道的話，我們就可以提供產前診斷，扣除抽羊水的費用，只要付擔台幣一千五百元（而非三萬元）。關於基因檢測結果的後續治療選擇，我們可用人工電子耳及家族性乳癌基因檢測做很好的例子。上述提及的人工電子耳，目前作最多是長庚，但台大也開始做這方面的手術和推廣，先篩選患者的基因背景，再搭配合適的療法；再者，像家族性乳癌的基因，大家都知道安潔莉納裘莉選擇預防性切除手術，這也是一種 actionable choice（配套）。除了預防性手術切除外，根據該基因檢測結果因而增強定期追蹤檢查（抽血及影像學檢查）的頻率及完整度，相信是更多人做的選擇。目前台灣有沒有人預防性切除? 我不知道，但乳癌基因檢測確實會影響到後續的醫療行為。
對您而言，NGS 臨床應用最大的挑戰和困難是什麼?
答：
Wet lab 和 dry lab (註) 仍有改進的空間
我認為 NGS 在前端處理和後端分析的階段都還有進步空間。就標靶序列捕獲（Target Enrichment）來說，我們希望 capture（捕獲）整個基因的區域，但若經驗不足或還在最佳化（Optimization）階段，就可能捕獲得不太均勻。若應該定序到的地方沒有定序到，就會漏掉重要訊息，所以並不是那麼簡單。定序完後的分析也需要高度專業與經驗才能正確完成，如果有家公司宣稱他的檢驗報告是對的，收到報告的醫師、病患或家屬該如何判斷真偽?其實很困難，我們自己做內部會知道有多少把握，但外部的客觀標準要到達國際的標準品質才可以，但老實說，目前大家都還不是很會分析，敢像我們這樣蓋章、發醫療等級報告的醫療機構其實很少。
人為疏失難避免 軟體整合為關鍵
目前我們的檢體數目還在我們實驗室能夠處理完的程度，所以我們實驗室的技術員、博士後或學生，將多套軟體串聯起來，得到的結果再由人力做一定程度的分析與檢驗。但是，只要牽涉到人為就可能會犯錯，且人為比對資料庫的速度沒有機器來得快，再者，如果整個流程有建立 SOP，機器會完全按照 SOP 走，所以每個階段都可以追蹤，但若加入人工，要回頭找出錯的點會很困難，所以我們預計把目前的半人工作法降低為僅 5% 依賴人工，95% 靠軟體串連。然而，這些軟體也須要足夠的臨床數據來驗證其正確性，所以我們根據過去已分析完成的數百個檢體的數據當作標準值去測試，當然我們希望該軟體不僅該抓到的資訊都沒有漏掉，還可以找出以前沒有見過的，我們才會選擇以它來輔助診斷，這是很大的挑戰，目前國外有幾個軟體號稱可以克服人工的盲點，但是我們還沒有全部測試完成。
如果某項疾病有一百個可能的致病基因，其得病率是把每個致病基因的百分比加總嗎?
答：不是。如果我們從兩個軸向來做分析，橫軸是疾病『盛行率』，而縱軸是致病基因的致病風險『強弱』。盛行率為 1-10%（或更高比例）的疾病稱為複雜性疾病（complex disease），如第二型糖尿病、高血脂、晚發性癌症等，這一類的疾病可能可以找出數十個到數百個致病基因，但每個基因找到的致病變異點只增加風險為 1.06, 1.13 等很小的風險倍數，這一大類的複雜性疾病，即便做了許多基因檢測，所有的基因型鑒定結果還是沒有辦法加總起來成為疾病風險預估的好指標。另外一種則是孟德爾遺傳疾病（Mendelian diseases），可能大約一千人到一萬人以上才有一位患者，但該疾病的基因所帶來的風險卻是一千倍、五千倍甚至一萬倍，這就是我們在醫療遺傳學裡主要的應用。比如某個家族具有單基因疾病的遺傳因子，致病基因的風險是五千倍到一萬倍，只要作基因檢測就可精準得知某位家族成員會不會發病，而不像第二型糖尿病（即每個致病基因的風險百分比都很低），即使做了基因檢測，還是無法準確預測得病率，這也是一些知名的基因檢測公司如 23andMe、deCODE genetics 失敗的原因，他們原先以為很多複雜性疾病都可透過 GWAS 找到致病基因，只要把每個人的單核苷酸多型性（Single-nucleotide polymorphism, SNP）都基因型鑑定（genotyping）完，將變異點湊一湊加起來就可預測得糖尿病的機率，後來才發現這不可行，而且也不該做，因為會帶給消費者不精確或是影響力很小的結果，臨床上也幾乎不能用。基因檢測必須針對帶有數百倍到數千倍風險的致病因子才值得做，如服用抗癲癇藥 Carbamazepine（CBZ），若帶有 HLA-B*15:02 基因型，就會有百倍以上的風險發生「史帝文生強生症」（Stevens-Johnson Syndrome, SJS），現在健保也有給付這項檢測；再例如先天性耳聾或是結節硬化症，如果檢測到明確的致病基因，就會比一般人高出千倍以上的發病風險。
您上述提及的風險百分比，這裡有個疑問：以乳癌為例，乳癌有很多相關的致病基因，也許該基因導致乳癌的風險並不大，但導致其他癌症的風險比較大，該如何衡量?
答：不同的癌症領域有一定的判斷準則，譬如在典型的 BRCA1、BRCA2、TP53 上看到功能損失（lose of function）的致病變異點，就會判斷罹癌的風險大增百倍到千倍，但如果這類「大聯盟等級」的基因致病變異點都沒有找到，再看小聯盟等級的基因時，其可靠性或判讀就會比較弱。前面所述的複雜性疾病（complex disease），影響的人其實很多，如糖尿病可能十個人裡就有一人罹患，但在精準醫療上還不是很好用，所以目前在疾病的診斷和諮詢仍以單基因疾病為主。
在大數據時代，國外資金充足的醫院或研究機構投入很大的資源試著把基因體資料和電子病例結合，希望能發現明確的致病基因，而他們目前的目標主要是研究，不過未來可能有機會直接轉換為個人化醫療及諮詢等。在 2017 – 2018 年，我們的實驗室主力檢測項目之一一定還會是以疾病基因檢測 panel 為主，因為它比 WES 更聚焦我們想看的、也更有效率。而一旦 gene panel 遇到無法解答的困難案例，例如是神經系統或發育異常，因為沒有單一臨床症狀可幫助診斷，這時就會使用 WES 和 WGS 試圖找出致病原因，所以 WES 也是我們 2017 年發展的重要方向。對於精準醫療的另一個重要領域─癌症，我們的實驗室由另一位專家林柏翰醫師有針對家族性遺傳的癌症（包括家族性乳癌、卵巢癌、大腸直腸癌等等）做檢測，至於用腫瘤組織作定序或液態檢體（liquid biopsy）從周邊血去偵測腫瘤的基因組成（genetic profile），我們正在發展，但目前仍以預防性為主。
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陳沛隆醫師 小檔案
台大醫學系畢業
台大醫院內科內分泌暨新陳代謝科住院醫師（Resident）
美國約翰霍普金斯（Johns Hopkins）醫學院人類遺傳學博士
台大醫院基因醫學部及內科部主治醫師
台灣大學基因體暨蛋白體醫學研究所副教授
註解：
何謂「乾」、「濕」實驗室 ?
在生物學、化學、遺傳學或生化學領域，濕實驗室 (wet lab)是指放置許多化學物質、藥物試劑、細胞及其他樣本等等，實際進行分子生物學、細胞生物學等等實驗之實驗室。乾實驗室 (dry lab) 則為在電腦系統進行運算、模擬、資訊分析等。隨著軟體功能越趨強大與大數據應用盛行，許多科學家將濕實驗室之結果送到乾實驗室進行電腦分析，近年來扮演生物科技發展關鍵角色的生物資訊學 (bioinformatics) 就是 wet lab 以及 dry lab 完美結合的一個很好例子。
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