次世代定序 (next-generation sequencing, 简称 NGS) 相当为人所熟知的两大应用，为非侵入性产前检测 (NIPT) 和癌症基因检测，但其实特殊单基因疾病（single gene disease 或称 Mendelian disease）也是非常受重视的领域，而 NGS 在特殊疾病的基因检测及应用一直都是台大医院基因医学部的主轴之一，因此我们拜访了任职于台大医院基因医学部陈沛隆医师。陈医师为遗传学家、内分泌科医师，也是台大基因体暨蛋白体医学研究所的副教授，长期致力找出各种人类疾病的致病基因，过去从使用连锁分析及全基因体相关研究，到后来接触 NGS，并专注于该技术之临床应用，希望找出致病基因后，对基因诊断、遗传咨询、治疗方式之选择以及疾病病理生理机转都能有更深入地了解，造福更多病患。此次访谈，陈医师和我们分享了 NGS 在遗传学与基因医学上的重大贡献，以及对于临床上的困难与挑战提出可行的解决方案。
您是如何踏入医学遗传学的领域，从事次世代定序 NGS 的应用?
答：我担任台大医院内分泌科总医师，并且就读台大医学院临床医学研究所硕士班时，试图找出葛瑞夫兹氏病（Graves’ disease）的致病基因，因而踏入遗传学研究的领域，于美国约翰霍普金斯大学攻读人类遗传学博士时，更决定结合遗传学与临床医学的专长作为一生研究与服务的主轴。在遗传学研究上，1990 年代到 2000 年初，寻找致病基因的方法为连锁分析（linkage analysis），从带有特定遗传疾病的家族（如安洁莉娜·裘莉的家族具有早发性的家族性乳癌/卵巢癌）着手，但仅限于单基因疾病（single gene disease）或称为孟德尔遗传疾病（Mendelian diseases）。到 2005 年，全基因体相关研究（Genome-wide association study, GWAS）问世，主要针对复杂性疾病（complex disease），即数十到数百个基因因素并合并环境因子所共同造成的疾病如糖尿病、肥胖、精神分裂症等。NGS 也在此时萌芽，2005 年第一篇 NGS 相关论文发表，2006-2007 年开始在研究上以及临床应用上有所发展，接着下来的几年内出现以 NGS 寻找致病基因的浪潮，而我也在 2009 年以后正式利用 NGS 进行学术研究以及临床应用。
从 2010 年开始，我们便和耳鼻喉科的许权振教授和吴振吉医师合作，将 NGS 应用于耳聋研究和治疗。2013 至 2015 年台大医院交付基因医学部一项重要任务，要规划并执行‘A1 计画（新时代遗传基因医学中心）’，设立 NGS 的临床服务与学术研究的实验室。一开始便建立结节硬化症（Tuberous sclerosis complex , TSC）、家族性乳癌（Familial breast cancer）及家族性大肠直肠癌（Familial colorectal cancer）的基因检测。后来更逐渐拓展到先天性听损（Congenital hearing impairment）、帕金森氏症（Parkinson’s disease）、早发性失智症（Dementia of early onset）、 多囊性肾脏病（Polycystic kidney disease, PKD）、视网膜色素病变（Retinitis pigmentosa, RP）、单基因黄疸（Single-gene jaundice）、粒线体疾病（Mitochondrial disease）、嗜铬细胞瘤及副神经节瘤（Pheochromocytoma and paraganglioma）、遗传性心律不整（Hereditary arrhythmia）等多种疾病。目的是将这些疾病的众多基因，建立为临床基因检测，有助于病人之确定诊断及遗传咨询，也可能找到适合病人之精准医疗。
精准医疗好贵? 病人没钱怎么办?
通常，单基因疾病是用传统的桑格定序（Sanger sequencing）来做，这样的检测方式的成本受到需要检测的基因的数目以及大小影响很大，平均估算起来大约一个基因收费一万元。但以耳聋来说，有 80 个可能的致病基因就要台币 80 万，对病患来说负担太重。此外，人类大约有超过两万个基因，所谓的全表现子定序（whole exome sequencing, WES）就是对两万个基因的编码区域（coding region）全部定序，但如果有兴趣的基因只有 200 个，仅占人类整体基因的 1/100，却用 WES 来看所有的基因，其实是浪费了百分之九十九的定序结果，殊为可惜。所以，台大医院的基因检测 panel（disease gene panel）也就应运而生，使分析更有效率，甚至连内含子（Intron，即 DNA 中非编码之片段）、非转译区（untranslated region, UTR）这些 WES 无法检测到的都包含在内。举例来说，针对先天性听损目前已知的 160 个可能单基因致病基因，我们目前利用次世代定序基因检测 panel 来做基因诊断，收费可压制在三万元，比起传统方式或 WES 方式在花费上都减低很多，但检出率反而更高。此外，耳聋的终极治疗方式─人工电子耳，装置过程须耗费台币一百万，虽然对多数人都有效果，但有些人却没有改善，透过台大医院和长庚医院的合作，我们分析患者在该次世代定序基因检测 panel得到的基因型，从中发现两个特别的基因，会使人工电子耳治疗的效果显著不良。这是全世界最领先的发现。未来如果能根据这样的基因型鉴定结果来决定人工电子耳治疗的选择，可谓精准医疗、个人化医疗的良好例证。
延伸阅读：后 NGS 时代的生技浪潮NGS 应用不只是 NIPT 与癌症 特殊单基因疾病也是重点
不少人提到 NGS 的临床应用时，都先想到 NIPT 或癌症，但特殊疾病是我们的主轴。单基因疾病的罹病机率通常落于千分之一到万分之一之间，虽然以个别疾病来看，比例似乎不高，但就全台湾（或全世界）来看，个别疾病的总病人数就相当多，再乘以各种类的疾病数目，则整体来说罹患有特殊单基因疾病的患者及家族史是相当多的，也就是‘有市场’的。很多单基因疾病的病人希望得到基因诊断、咨询或治疗建议，最近迈入 NGS 时代，相较于台湾其他诊所主战场皆在 NIPT、PGS 或 PGD，我们的实验室主要还是投入在单基因疾病的部分，希望帮助更多这类疾病的患者与家属。
台大医院 陈沛隆医师
这些基因检测做完，后续的配套措施为何?
答：如同我们一直谈到的，这样的基因检测服务可帮助达到基因诊断、遗传咨询或治疗建议。例如不少罕见疾病登录或重大伤病卡申请，都需要确实的基因诊断，才能符合规定进行申请。就遗传咨询的角度，透过有经验的基因医学医师或遗传咨询师，可针对家族谱系建议哪些家族成员需接受基因检测、哪些成员不用担心、哪些临床上无症状的家属可能带有致病变异点等讯息。而且如果未来要怀孕生子，而家族内的致病变异点已透过次世代定序检测而确定知道的话，我们就可以提供产前诊断，扣除抽羊水的费用，只要付担台币一千五百元（而非三万元）。关于基因检测结果的后续治疗选择，我们可用人工电子耳及家族性乳癌基因检测做很好的例子。上述提及的人工电子耳，目前作最多是长庚，但台大也开始做这方面的手术和推广，先筛选患者的基因背景，再搭配合适的疗法；再者，像家族性乳癌的基因，大家都知道安洁莉纳裘莉选择预防性切除手术，这也是一种 actionable choice（配套）。除了预防性手术切除外，根据该基因检测结果因而增强定期追踪检查（抽血及影像学检查）的频率及完整度，相信是更多人做的选择。目前台湾有没有人预防性切除? 我不知道，但乳癌基因检测确实会影响到后续的医疗行为。
对您而言，NGS 临床应用最大的挑战和困难是什么?
答：
Wet lab 和 dry lab (注) 仍有改进的空间
我认为 NGS 在前端处理和后端分析的阶段都还有进步空间。就标靶序列捕获（Target Enrichment）来说，我们希望 capture（捕获）整个基因的区域，但若经验不足或还在最佳化（Optimization）阶段，就可能捕获得不太均匀。若应该定序到的地方没有定序到，就会漏掉重要讯息，所以并不是那么简单。定序完后的分析也需要高度专业与经验才能正确完成，如果有家公司宣称他的检验报告是对的，收到报告的医师、病患或家属该如何判断真伪?其实很困难，我们自己做内部会知道有多少把握，但外部的客观标准要到达国际的标准品质才可以，但老实说，目前大家都还不是很会分析，敢像我们这样盖章、发医疗等级报告的医疗机构其实很少。
人为疏失难避免 软件整合为关键
目前我们的检体数目还在我们实验室能够处理完的程度，所以我们实验室的技术员、博士后或学生，将多套软件串联起来，得到的结果再由人力做一定程度的分析与检验。但是，只要牵涉到人为就可能会犯错，且人为比对数据库的速度没有机器来得快，再者，如果整个流程有建立 SOP，机器会完全按照 SOP 走，所以每个阶段都可以追踪，但若加入人工，要回头找出错的点会很困难，所以我们预计把目前的半人工作法降低为仅 5% 依赖人工，95% 靠软件串连。然而，这些软件也须要足够的临床数据来验证其正确性，所以我们根据过去已分析完成的数百个检体的数据当作标准值去测试，当然我们希望该软件不仅该抓到的资讯都没有漏掉，还可以找出以前没有见过的，我们才会选择以它来辅助诊断，这是很大的挑战，目前国外有几个软件号称可以克服人工的盲点，但是我们还没有全部测试完成。
如果某项疾病有一百个可能的致病基因，其得病率是把每个致病基因的百分比加总吗?
答：不是。如果我们从两个轴向来做分析，横轴是疾病‘盛行率’，而纵轴是致病基因的致病风险‘强弱’。盛行率为 1-10%（或更高比例）的疾病称为复杂性疾病（complex disease），如第二型糖尿病、高血脂、晚发性癌症等，这一类的疾病可能可以找出数十个到数百个致病基因，但每个基因找到的致病变异点只增加风险为 1.06, 1.13 等很小的风险倍数，这一大类的复杂性疾病，即便做了许多基因检测，所有的基因型鉴定结果还是没有办法加总起来成为疾病风险预估的好指标。另外一种则是孟德尔遗传疾病（Mendelian diseases），可能大约一千人到一万人以上才有一位患者，但该疾病的基因所带来的风险却是一千倍、五千倍甚至一万倍，这就是我们在医疗遗传学里主要的应用。比如某个家族具有单基因疾病的遗传因子，致病基因的风险是五千倍到一万倍，只要作基因检测就可精准得知某位家族成员会不会发病，而不像第二型糖尿病（即每个致病基因的风险百分比都很低），即使做了基因检测，还是无法准确预测得病率，这也是一些知名的基因检测公司如 23andMe、deCODE genetics 失败的原因，他们原先以为很多复杂性疾病都可透过 GWAS 找到致病基因，只要把每个人的单核苷酸多型性（Single-nucleotide polymorphism, SNP）都基因型鉴定（genotyping）完，将变异点凑一凑加起来就可预测得糖尿病的机率，后来才发现这不可行，而且也不该做，因为会带给消费者不精确或是影响力很小的结果，临床上也几乎不能用。基因检测必须针对带有数百倍到数千倍风险的致病因子才值得做，如服用抗癫痫药 Carbamazepine（CBZ），若带有 HLA-B*15:02 基因型，就会有百倍以上的风险发生“史帝文生强生症”（Stevens-Johnson Syndrome, SJS），现在健保也有给付这项检测；再例如先天性耳聋或是结节硬化症，如果检测到明确的致病基因，就会比一般人高出千倍以上的发病风险。
您上述提及的风险百分比，这里有个疑问：以乳癌为例，乳癌有很多相关的致病基因，也许该基因导致乳癌的风险并不大，但导致其他癌症的风险比较大，该如何衡量?
答：不同的癌症领域有一定的判断准则，譬如在典型的 BRCA1、BRCA2、TP53 上看到功能损失（lose of function）的致病变异点，就会判断罹癌的风险大增百倍到千倍，但如果这类“大联盟等级”的基因致病变异点都没有找到，再看小联盟等级的基因时，其可靠性或判读就会比较弱。前面所述的复杂性疾病（complex disease），影响的人其实很多，如糖尿病可能十个人里就有一人罹患，但在精准医疗上还不是很好用，所以目前在疾病的诊断和咨询仍以单基因疾病为主。
在大数据时代，国外资金充足的医院或研究机构投入很大的资源试着把基因体资料和电子病例结合，希望能发现明确的致病基因，而他们目前的目标主要是研究，不过未来可能有机会直接转换为个人化医疗及咨询等。在 2017 – 2018 年，我们的实验室主力检测项目之一一定还会是以疾病基因检测 panel 为主，因为它比 WES 更聚焦我们想看的、也更有效率。而一旦 gene panel 遇到无法解答的困难案例，例如是神经系统或发育异常，因为没有单一临床症状可帮助诊断，这时就会使用 WES 和 WGS 试图找出致病原因，所以 WES 也是我们 2017 年发展的重要方向。对于精准医疗的另一个重要领域─癌症，我们的实验室由另一位专家林柏翰医师有针对家族性遗传的癌症（包括家族性乳癌、卵巢癌、大肠直肠癌等等）做检测，至于用肿瘤组织作定序或液态检体（liquid biopsy）从周边血去侦测肿瘤的基因组成（genetic profile），我们正在发展，但目前仍以预防性为主。
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陈沛隆医师 小档案
台大医学系毕业
台大医院内科内分泌暨新陈代谢科住院医师（Resident）
美国约翰霍普金斯（Johns Hopkins）医学院人类遗传学博士
台大医院基因医学部及内科部主治医师
台湾大学基因体暨蛋白体医学研究所副教授
注解：
何谓“干”、“湿”实验室 ?
在生物学、化学、遗传学或生化学领域，湿实验室 (wet lab)是指放置许多化学物质、药物试剂、细胞及其他样本等等，实际进行分子生物学、细胞生物学等等实验之实验室。干实验室 (dry lab) 则为在电脑系统进行运算、模拟、资讯分析等。随着软件功能越趋强大与大数据应用盛行，许多科学家将湿实验室之结果送到干实验室进行电脑分析，近年来扮演生物科技发展关键角色的生物资讯学 (bioinformatics) 就是 wet lab 以及 dry lab 完美结合的一个很好例子。
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