预测下一个生技世代的风貌(二)： CRISPR 的积极进取

有了基因体、蛋白质体资讯可寻找突变基因和即时观察各种蛋白质的表现，让研究人员更能掌握生物体的运作及更有效地找出各种病原与异常。但最后一道关卡长期以来难以突破，就是：发现问题之后该怎么办？过去面对基因突变，顶多只能用 RNA 干扰尝试抑制基因表现，但既无法确保所有细胞的突变基因都被抑制，也无法改善基因突变后导致蛋白质无法表现的相关病症。对于折叠或修饰失败的蛋白质 (如狂牛病的 Prion) 只能用抗体加以捕捉或小分子药物进行抑制，但仍无法改变造成错误的根本机制。不过，这一切随着 CRISPR 技术出现，正逐渐展露曙光。目前已有 CRISPR-Cas9 用于治疗乙型 (β) 地中海型贫血、镰刀型贫血等血液遗传疾病的研究；甚至针对各种癌症，以及爱滋病病毒 (HIV)、人类乳突病毒 (HPV) 等，也都找到 CRISPR 可介入的方向并积极投入研究当中。

认识 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)

所谓 CRISPR，是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (群聚且有规律间隔的短回文重复序列) 之缩写，最早在 1987 年由日本研究员石野良纯等人在大肠杆菌中发现。到了 2002 年，欧美研究人员更进一步发现一系列与 CRISPR 相关的 Cas (CRISPR-associated genes) 基因，并证明这些基因转译出的 Cas 蛋白是具有剪辑 DNA 功能的核酸酶。CRISPR 能辨识特定的 DNA 序列，且 Cas 酵素具有剪辑 DNA 的作用，让基因编辑术突飞猛进。过去受限于编辑工具无法准确定位，但 CRISPR 技术问世后，研究人员得以针对特定片段或基因进行置换。例如，若想剔除某一致癌基因，可先针对周边 DNA 序列设计互补的 RNA 片段，然后插入人工 CRISPR 系统。接着将 CRISPR 系统与现在最常用的 Cas9 核酸酶导入目标细胞，人工 RNA 片段即会找到可互补的 DNA 区段进行配对，接着诱导 Cas9 针对特定位置剪辑 DNA。如此一来便可大幅提升成功率，避免切错位置导致的后遗症。

以 CRISPR 客制基因剔除细胞株

过去只能用 RNA 干扰技术尝试抑制基因表现，但现在可将人工设计的 CRISPR-Cas9 质体转染 (transfection) 至目标细胞，便可从源头在特定 DNA 序列位置删除或加入所需基因。如果搭配报导质体 (surrogate reporter，转染成功会表现出萤光、抗药性、或特定基因)，就能更有效筛选被剔除或加入特定基因的单株细胞，大大提升实验细胞株的制作效率及品质。另外，CRISPR 可利用于一一剔除细胞内的基因以个别分析其功能，而若将被剔除单种基因的单株细胞组成完整之细胞库 (library)，届时想研究什么基因只须像上图书馆借书般从细胞库选出对应的细胞即可，既简单又直观！台湾生技公司如图尔思生物科技也提供细胞株，动物基因编辑的客制化服务。

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以 CRISPR 客制实验动物

实验动物如老鼠及斑马鱼是生医研究和新药开发的重要角色，而透过 CRISPR-Cas9 技术诱发特定基因表现，便可针对不同状况模拟相应的生物体环境。随着新技术发展，Cas9 重组蛋白可以直接打入胚胎，省去从质体 (plasmid) 转录、转译蛋白质的过程，并大幅增加诱导式多能性干细胞 (induced pluripotent stem cell， iPSC) 以及纤维母细胞 (fibroblast) 等不易进行基因编辑的细胞之转染成功率。故相较于传统胚胎干细胞选殖，CRISPR 可大幅缩短基改动物的制造时程，甚至能跨越物种限制，例如将人类基因嵌入小鼠基因体进行表现。

日新月异的 CRISPR 工具

最基本的 CRISPR-Cas9 系统已经广泛运用于分子生物学研究，但临床应用仍有许多障碍，这包含：

Cas9 酵素由 Cas9 蛋白质与 guide RNA (gRNA) 组成，而 gRNA 包含与目标基因互补的 crRNA 及和 Cas9 蛋白质结合的 tracRNA。因此 Cas9 蛋白质须先与 gRNA 结合，作用于目标基因后才会启动剪辑功能。
Cas9 剪辑目标基因后，会留下钝端 (blunt end)，也就是 DNA 序列直接被平整切断，不利将修正好的 DNA 序列换置到目标基因原来的位置。
Cas9 有明确的切点，但如果这个切点发生突变，CRISPR-Cas9 就会失效。
误切目标基因以外的位置，通称为“脱靶效应”，可能导致严重后果甚至引发癌症。

有鉴于此，当前科学家也积极在发掘各种效率和功能更先进的 CRISPR 模组。例如最新的 CRISPR-Cpf1，其功能与 Cas9 类似，但却拥有几个优点，例如：更容易送入细胞和组织、Cpf1 仅需搭配一段 RNA 进行配对即可剪辑、还能在剪辑后留下方便置换新 DNA 序列的黏端 (sticky end)、以及更重要的是 Cpf1 所辨识的序列离切点有一段距离，因此即使切点发生突变，Cpf1 的功能仍不受影响。

另外针对脱靶效应，科学家也透过诱发 Cas9 基因在特定位置发生突变以改变 Cas9 蛋白的带电性质。DNA 是带负电，Cas9 蛋白质和 DNA 结合的位置为正电，因此如果可以把某些带正电的氨基酸换成中性，来降低对默认目标以外位置的亲合力，将可减少脱靶效应的发生率。实验结果发现 3 个胺基酸的突变可以大幅减低脱靶效应，这个新的蛋白质称为 eSpCas9。而图尔思科技也成功开发及提供 eSpCas9 protein 与 cpf-1 protein。

近期中国科学家韩春雨教授发表新的基因编辑工具 NgAgo 蛋白，是透过 DNA 进行诱导的新兴技术 (不同于 Cas9 蛋白以 RNA 进行诱导)，比起 Cas9 来说有灵活性更高(不需要以 PAM 辨识)、体积较小 (适用更小的病毒载体)、脱靶率可能较低等优点，且赖以诱导的 DNA 较 RNA 更容易合成，并在细胞内更能保持稳定。不过目前全世界都有科学家正在测试及重复 NgAgo 的活性与再现性，似乎都认为 NgAgo 的效率不如想像中的好，但韩春雨教授也公布他详细的实验方法和注意事项让大家检验，所以或许 NgAgo 这个工具要发展成熟还需要点时间。

除此之外，科学家亦努力发掘其他 CRISPR 相关酵素，未来可望建立完整的工具箱，视对象、目的、细胞类型、或目标基因组合出最佳的 CRISPR 系统进行操作。

影片分享：
你知道当前最热门的生物技术有哪些吗 ? 由周士轩博士谈 NGS、CRISPR 的趋势、新的研究发现，以及在转译医学、临床治疗上的应用。欢迎点阅：
Trends in Biotools- Translating NGS and CRISPR into Biological Fields – 周士轩博士
http://pics.ee/DVe

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