堪称本世纪最大的生物技术发现 ― CRISPR，让基因的修饰、剪辑、或插入易如反掌。由细菌抵抗病毒感染的防卫系统所衍伸而来的 CRISPR，本质上就是利用导引 RNA 序列锁定细胞内的目标序列，再以 Cas9 核酸酶进行剪辑。如此一来，因为基因发生突变、出现缺陷、复制数 (copy number) 太多所造成的先天性疾病，未来都可望透过 CRISPR 而获得解决。发现 CRISPR 功劳最大的三位科学家：Emmanuelle Charpentier、Jennifer Doudna、和 Feng Zhang 确实贡献卓著，并同时获得 2016 年唐奖的生技医药奖。
表观遗传学的问题可否透过 CRISPR 解决？
基因序列出现问题，固然可透过 CRISPR 进行编辑而获解决；但如果基因序列没有问题，而是基因表现发生异常，该怎么办？表观遗传学泛指影响基因表现的各种后天修饰，其中最常见的表观遗传修饰之一为 DNA 甲基化 (methylation)。构成 DNA 的腺嘌呤 (adenine, A) 和胞嘧啶 (cytosine, C) 碱基可被甲基化，不过 adenine 甲基化只会在细菌等原核生物发生。而在所有脊椎动物，cytosine 的甲基化会造成该基因的表现受限，无法产生相对应之蛋白质。若该基因原先会促进某种生理反应，甲基化会使基因表现萧条，生理反应就无法正常进行；举例来说，甲基化会缓和动脉平滑肌细胞的再生，最后会使血管壁失去弹性而逐渐硬化，进而引发心血管疾病。相对来说，若被甲基化的基因原先负责抑制某种生理作用以免身体过度反应，甲基化就会让该生理反应失控；例如癌症的发生就与肿瘤抑制基因的甲基化有密切关系。目前已知 21 世纪所有重大文明病 ― 癌症、糖尿病、心血管疾病、脑血管疾病、老化相关并发症等等，全部都与甲基化有密切关联性。所以当生物医学界体认到 CRISPR 编辑基因的潜力后，研究人员积极想解明的下个问题就是：CRISPR 可否修饰 DNA 甲基化？
CRISPR 可用来甲基化 DNA
在 2016 年春天，克罗地亚札格雷大学的研究团队1和美国华盛顿大学圣路易分校2的研究团队分别发表可将 DNA 甲基化的 CRISPR 系统。两个团队都是利用失去功能的 Cas9 核酸酶结合 DNA 甲基化酵素 DNMT3A 的活性单位，再搭配导引 RNA 送入细胞。结果显示这样的系统可针对目标序列周边 35-50 个碱基对的 DNA 进行甲基化，成功率在 50% 以上。后续分析也显示被甲基化的基因之表现也确实被降低1,2。研究人员设计这样的系统是希望建立模拟甲基化相关疾病的细胞或动物模型，但其成果也间接证实 CRISPR 系统搭载甲基化相关酵素确实可对目标基因序列发生作用。下一步，当然就是要将 CRISPR 系统搭配去甲基化酵素，挑战未知。
CRISPR 也可用来将 DNA 序列去甲基化
中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所的团队在 2016 年 5 月随即发表以 Tet1 去甲基化酵素结合失去功能的 Cas9 核酸酶，成功在人类子宫颈癌细胞株 (HeLa) 针对目标 DNA 序列进行去甲基化3。研究团队选择使用 Tet1，是因为这是比较小巧的去甲基化酵素，所以比较容易送入细胞。研究结果也显示送入该系统后，目标基因的 mRNA 表现量即可提高 5-60 倍，效果非常显著3。之后在 2016 年 9 月，美国麻省理工学院的 Rudolf Jaenisch 实验室也发表以 Cas9 搭配 Tet1 或 DNMT3 的 CRISPR 系统，在实验小鼠身上成功进行目标基因序列的甲基化和去甲基化4。Rudolf Jaenisch 教授是德裔美国人，在 1974 年与 Beatrice Mintz 共同建立了史上第一组基因转殖小鼠，因此被封为“基因转殖鼠之父”。近年来，Jaenisch 教授积极投入表观遗传学的研究，而这次发表的 CRISPR 甲基化–去甲基化系统不仅有机会让他再被封为“表观遗传小鼠模型之父”，更显示 CRISPR 可在活生生的哺乳类动物进行目标基因序列的去甲基化。这也表示表观遗传学相关疾病亦可望透过 CRISPR 获得解决，对于癌症治疗、文明病的改善、甚至老化的逆转都有重大意义。
去甲基化得永生？
先前也有美国杜克大学医学中心的研究显示，失去功能的 Cas9 核酸酶可结合乙酰转移酵素 (acetyltransferase) p300，针对目标基因周边的组蛋白 (histone) 进行去乙酰化，进而促进该基因的表现5。有了可进行甲基化、去甲基化、和去乙酰化的 CRISPR 工具，表观遗传疾病的研究将会突飞猛进，而届时若先天性疾病和后天性疾病都能直接进行基因体修饰而解决，人类会经历一场前所未有的健康和医学革命！不过这之中还有更惊人的可能性：目前已知人类胚胎细胞在发育的过程会逐渐分化为各器官的专业细胞，这个过程的关键就是 DNA 甲基化。同理，干细胞在发展为体细胞的过程中，亦有特定基因发生不可逆的甲基化，这也是为什么体细胞不会再回溯成为干细胞。而随着体内干细胞逐渐转为体细胞而消耗殆尽，人体器官的损耗就没有细胞可以填补，久而久之就会老化，最后个体就会死去。但是如果 CRISPR 系统可将这些特定基因去甲基化，或许体细胞就有机会回溯为干细胞，让身体的再生能力源源不绝，长保青春。也许永恒的秘密，就藏在去甲基化之中…
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──黄富楠／“基因线上”总编辑
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参考文献：
1. Vojta A et al. Nucleic Acids Res 2016; 44:5615-28.
2. McDonald JI et al. Biol Open 2016; 5:866-74.
3. Xu X et al. Cell Discov 2016; 2:16009.
4. Liu XS et al. Cell 2016; 167:233-247.e17.
5. Hilton IB et al. Nat Biotechnol 2015; 33:510-7.
