提升 CRISPR 效率,Repair-seq 筛选工具突破技术瓶颈!

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基因编辑是现今先进的疗法之一,其中 CRISPR 技术发现者去年因此获得诺贝尔奖。尽管 CRISPR 被广泛应用基改作物、动物,也有许多人体治疗案例,但基因编辑仍难以避免脱靶效应(off-target),这会使得基因产生非预期的突变。

普林斯顿大学(Princeton University)团队近期连续刊登于《Cell》两项研究,提出一种名为“Repair-seq”筛选工具,借由分析 DNA 修复机制,有效提升 CRISPR 编辑效率及精准度。

Repair-seq 结合 CRISPR 分析 DNA 修复机制

当 DNA 损坏时会启动自动修复机制,这项机制也跟基因编辑有关,因为破坏双股 DNA 即是基因编辑的第一步骤,一旦过程有失误就会造成意外的突变。

为了了解修复 DNA 损伤的机制如何改善基因编辑效率,研究团队先以 CRISPR/Cas9、Cas12a 工具破坏 DNA 结构,接着再透过 repair-seq 筛选出不同的 DNA 修复机制。

在 476 个筛选出与 DNA 修复有关的基因中,包含 DNA1MCM10 参与基因片段修复的机制。其他完整的基因图谱也可在线上数据库搜索。

Prime editing 筛选出干扰 DNA 修复途径  

研究团队也应用麻省理工学院(MIT)提出的 prime editing 技术,prime editing 只切割单股 DNA。该技术同样利用引导 RNA 将 Cas9 结合至标靶位点,在 DNA 被破坏之后,研究团队再一一关闭 476 个与 DNA 修复功能有关基因,并以 repair-seq 检视分别造成的影响。

结果显示核酸错误配对修复(mismatch repair)机制,会阻挡 prime editing 作用,该团队也设计出能暂时关闭这项功能的表现蛋白 MLH1dn。

研究负责人 Adamson 教授提到,repair-seq 可以大量呈现基因编辑工具造成的影响。而只要能回避掉特定 DNA 修复途径(如:核酸错误配对修复),将能大幅提升基因编辑效率。

延伸阅读:用 CRISPR 编辑肠道菌!微生物疗法降低癌症免疫疗法副作用

参考资料:
1. Cell, 2021; https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)01176-4
2. Cell, 2021; https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)01065-5
3. https://www.princeton.edu/news/2021/10/20/princeton-led-studies-boost-crispr-gene-editing-prospects

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