CRISPR 检测 SARS-CoV-2 全球现况

随着新冠肺炎（COVID-19）在全球大流行，研究人员正在争分夺秒地开发诊断工具、疫苗和治疗方法。目前约 40 多种疫苗的临床试验正在进行中，专家评估最快也需半年才上市。另外，多家学术机构、非营利机构和生物制药公司也一直在利用 CRISPR技术的优势，以增强 COVID-19 药物的开发，并且开发快速诊断方式。

CRISPR 于 COVID-19 诊断之现况

目前，COVID-19 的检测能力受到许多因素的限制，例如复杂程序，对实验室仪器的需求以及对有限供应的依赖。因此，迫切需要快速检测试剂盒。2018 年起，CRISPR 已经被科学家们开发应用于传染病和其病原体（细菌和病毒）诊断，主要透过引导 RNA 与 Cas 家族蛋白的结合，该蛋白可切割标靶并切碎附近的 RNA 或 DNA，再透过恒温环状扩增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。当 CRISPR 命中目标时，报告分子释放萤光讯号，可以透过侵入性患者检体（例如血液、尿液或唾液）的检测试纸来进一步对此进行分析。目前有 SHERLOCK、DETECTR 等系统已经获得 FDA 紧急使用授权，FELUDA 获得印度药品总局核准使用，而 AIOD、CREST 等系统已发表于期刊，待进一步商业化。

EUA：紧急使用授权

1. SHERLOCK

SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 检测试剂组已经于 2020 年 5 月取得美国 FDA 紧急使用授权于诊断 SARS-CoV-2，该系统主要借由 Cas13 切割，并且可以装载到纸条上，类似于怀孕测试，非常容易使用，可直接用肉眼观察结果且无需昂贵设备，因此在任何环境中进行快速简单的检测，可在大约 1 小时内提供结果。

该检测试剂组主要检测 SARS-CoV-2 的开放读序框架（open reading frame, ORF1ab，DNA上会产生蛋白质部分）基因和核壳蛋白（nucleocapsid protein, N）基因中的片段。

该系统由布洛德研究所（Broad Institute）的张峰（Feng Zhang）博士及其团队所研发，并由其公司 Sherlock Biosciences 所发表。

2. DETECTR

由诺贝尔化学奖新科得主 Jennifer Doudna 教授和 Trevor Martin 共同创办的Mammoth Biosciences 研发的 SARS-CoV-2 DETECTR Reagent Kit 于 2020 年 8 月底取得美国 FDA 紧急使用授权于诊断 SARS-CoV-2。

该检测试剂组主要使用 Cas12a 进行切割，而不是 Cas9，并且结合等温扩增以提高 attomolar 灵敏度和特异性，来检测上呼吸道检体中的 SARS-CoV-2 的核壳蛋白（nucleocapsid protein, N）的片段基因，将不需要复杂的实验室环境、大型设备和耗时多步骤过程，可在 40 分钟内提供结果。在 83 个 SARS-CoV-2 阳性检体中，使用该检测方法再度检验，其阳性预测率达 95％，阴性预测率达 100％。

延伸阅读：Mammoth Biosciences开发第一个CRISPR疾病检测平台

3. FELUDA

FELUDA（FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay）是由印度科学和工业研究理事会的Debojyoti Chakraborty、Souvik Maiti 和 Tata Group 所领导的研究团队开发。他们使用 CRISPR-FnCas9 进行检测，在不到30分钟内可获得检测结果，其灵敏度为96％，特异性为98％。其中 FnCas9 对 DNA 中配对错误的存在以及这些错配的位置呈现高度敏感。

他们使用生物素化的引子透过 PCR/RPA 扩增标靶序列，然后用链亲和素（streptavidin）包覆的珠子将它们固定。再来，将包含没有错配的sgRNA的萤光标记dCas9复合物与固定的标靶序列结合。结合后，可以看到萤光的变化。另一种方法是将相同的概念应用于包含可与生物素化标靶（biotinylated targets）结合的链亲和素的侧流试纸条。

4. AIOD

AIDO （All-In-One Dual CRISPR-Cas12a）是由康乃狄克大学健康中心生物医学工程系 Changchun Liu 副教授的研究团队开发的一种“多合一双重 CRISPR-Cas12a 检测技术”，以使用低成本的暖手器作为培养箱，不需要昂贵电子设备，可在 20 分钟内得到检测结果。该检测方法也经过 RT-PCR 验证，能获得一致的结果，未来可望应用在家庭或小型诊所。

他们透过标靶 SARS-CoV-2 的核蛋白基因，引入了 2 个没有原型间隔子相邻基序（protospacer adjacent motif, PAM）位点限制的 CRISPR RNA，以开发AIOD-CRISPR 分析，并且其能检测具有少量拷贝敏感性的核酸。

5. CREST

CREST（Cas13-based, Rugged, Equitable, Scalable Testing）由加州大学圣塔芭芭拉分校 Maxwell Z Wilson 助理教授所开发。首先，提取 RNA 并进行反转录。然后使用 Taq 聚合酶通过PCR进行扩增，然后转录以提供 Cas13的 RNA 基质。在发现 gRNA 与给定的萤光标记基质之间存在互补性后，Cas13被活化并进行非特异性的侧链切割。该切割与萤光可视化耦合。然而，他们没有使用侧向流动条来检测萤光标记的RNA的裂解，而是使用了由9V电池供电的 P51 纸板萤光视觉化仪器，该电池使用蓝色 LED 和橙色滤光片来检测裂解后的萤光。整个流程，大约需要 1-2 小时。

另外，他们没使用典型的 PCR 仪器，而是使用了价格低廉、可现场使用、支持蓝牙的 PCR 仪器，它们甚至可以由电池供电，并且可以透过 DIY-Bio 机芯进行操作。

6. Jennifer Doudna 教授推新型 CRISPR- Cas13a 检测

Jennifer Doudna 教授的实验室近日也推出新型 CRISPR-Cas13a 检测，仅需 5分钟即可检测到 SARS-CoV-2。这种高处理速度是透过避免扩增病毒基因体的需要而实现的，这项新检测使用了针对病毒 RNA 不同部分的 CRISPR RNA 组合，并活化了每个病毒RNA的多个 Cas13a，进而增强了切割报告分子时产生的萤光信号。另外，他们可以使用手机镜头来测量萤光，操作简单且易于携带。

利用 CRISPR 制备疫苗，可行吗？

另一位诺贝奖化学奖新科得主法国微生物学专家 Emmanuelle Charpentier 博士提到，以目前的技术来说，透过 CRISPR 制备COVID-19疫苗，是不可能直接实现的。但是，仍可以透过 CRISPR 去了解病毒怎样复制，间接来帮助研究团队去开发疫苗。

延伸阅读：CRISPR史诗级革新病毒和肿瘤将无所遁形

参考资料：
1. https://eurowire.co/economy/321404/crispr-can-be-a-solution-to-address-the-covid-19-pandemic-roots-analysis/
2. https://sherlock.bio/sherlock-biosciences-receives-fda-emergency-use-authorization-for-crispr-sars-cov-2-rapid-diagnostic/
3. https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas
4. https://www.biospace.com/article/crispr-technology-edges-closer-to-commercial-use-/
5. https://doi.org/10.1101/2020.04.20.052159
6. https://blog.addgene.org/sars-cov-2-covid-19-detection-methods-based-on-crispr-cas
7. https://indianexpress.com/article/explained/feluda-coronavirus-covid-19-test-tata-sons-crispr-technology-6603573/
8. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.09.28.20201947v1
9. N Engl J Med 2020；383：1492-1494. DOI：10.1056 / NEJMc2026172
10. Nature Biotechnology volume 38, p870–874(2020)
11. Nat Commun 11, 4711 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-18575-6