南佛里达大学(University of South Florida)的研究团队利用恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)特殊的基因特性创造了 38,000 个突变株,并确定 2,680 个以上影响存活的必须基因,未来可望帮助研究人员筛选抗疟疾药物之新标的,相关研究成果已于 5 月 4 日发表于《Science》期刊。
在医药发达的 21 世纪,恶性疟原虫引起的疟疾仍普遍存在于赤道周围的热带及亚热带国家,每年多达数十万人因此死亡。拜青蒿素联合疗法(artemisinin-combination therapy,ACT)所赐,近年来疟疾疫情有大幅下降的趋势;然而,东南亚某些国家已发现对青蒿素具抗药性的疟原虫而导致治疗失败的案例,若该抗药基因蔓延至非洲,预计将引起毁灭性的疟疾反扑,如同 1970 年代鼎鼎大名的奎宁(Quinine),其药效随着大规模的使用而逐渐减弱。因应世界卫生组织(WHO)在西元 2040 年根除疟疾的目标,研发新药物或新疗程是无非是现阶段的首要任务。不幸的是,恶性疟原虫的基因体绝大多偏向 A-T 碱基对(>80%),使科学家难以利用同源重组(homologous recombination)或 CRISPR 等标靶技术深入研究基因的功能,过去几十年来仅成功建立数百个恶性疟原虫突变体。
为克服前述之技术性困难,研究团队改为利用优先插入 TTAA 序列之 piggyBac 跳跃子,在恶性疟原虫基因体的编码和非编码区域中,平均每 70 个碱基对就有一个插入位点,理论上可完成全基因体的定点饱和突变。为了扩大 piggyBac 突变的操作规模,研究团队开发了一种高通量技术,可使基因体仅产生单个跳跃子插入点,并结合 Illumina 定序方法鉴定该位点,亦称为 quantitative insertion-site sequencing (QIseq)。该团队利用机器手臂执行高通量转染突变技术(high-throughput transfection mutagenesis),将 piggyBac 跳跃子转染至野生型恶性疟原虫基因体,建立约 38,000 个突变株,全数皆经 Illumina 定序确认含有不同 piggyBac 的插入位点。
延伸阅读:罗马帝国也有疟疾,首度由 DNA 确认研究团队利用突变指数得分(mutagenesis index scores, MISs)及突变适应度得分(mutagenesis fitness scores, MFSs)分析发现,所有 piggyBac 跳跃子的插入位点共影响 5,399 个蛋白质编码基因,该团队并接续执行一系列的分析,以了解编码和非编码序列插入的分布、突变后造成的基因表现差异及虫体在竞争环境中之存活潜能。在此过程中,研究团队鉴定出 2,680 个恶性疟原虫感染血液阶段期间,于体外生长所必须的基因,包含抗药性相关基因:K13、mdr、dhfr-ts 及具新药标靶潜能之基因:pkg 及 cdpk5;另估计约有 1000 个未知功能的保守基因(conserved genes)将可能成为未来药物开发及抗药研究的新标的。
近期有关青蒿素联合疗法的遗传分析研究指出,恶性疟原虫泛素/蛋白酶体系统(ubiquitin/proteasome system)的细胞压力反应机转与其抗药性有关,研究团队利用 piggyBac 突变技术进一步发现涉及蛋白酶体降解的 72 个基因中,有 54 个被归类为必须基因,故可优先针对该反应途径设计药物标靶。此外,该团队亦发现蛋白酶体抑制剂 Bortezomib 可使青蒿素敏感的恶性疟原虫再提高 10 倍之敏感性。
本研究之通讯作者 John Adams 和 Rays Jiang 等表示,利用高通量饱和突变技术(high-throughput saturation mutagenesis)完整辨识恶性疟原虫生长的必须基因,将为疟疾治疗之路开启新的扉页,同时指出此策略亦为其他表型之系统性功能筛选开辟了新方法,如传播和细胞黏附等。John Adams 进一步表示,利用他们所建立的基因分析工具,将可鉴定每个基因对于恶性疟原虫生存的相对重要性,帮助指引为来药物发展的方向,并厘清青蒿素作用机制与蛋白酶体之间的关联。
延伸阅读:疟原虫如何流布无穷?文 / Angela Chang
参考文献:
1. http://science.sciencemag.org/content/sci/360/6388/eaap7847.full.pdf
2. https://www.genomeweb.com/sequencing/human-malaria-parasite-mutagenesis-highlights-essential-genes-potential-drug-targets#.WvEahKSFOUk
3. https://www.nih.gov/news-events/news-releases/essential-malaria-parasite-genes-revealed
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