次世代定序之跨世代竞合：究竟毛细管电泳于 NGS 扮演什么关键角色？

人类全基因体定序首度于 2003 年完成解码，共耗时 13 年；自此至今，估计有超过五十万人的全基因体完成定序，现今最先进的定序仪，甚至能在短短 2 天内同时完成 48 人的全基因体定序。定序速度会如此突飞猛进，完全仰赖次世代定序 (next-generation sequencing, NGS) 技术，让大量核酸片段可同步进行定序¹，通量上大幅超越第一代的毛细管电泳 (capillary electrophoresis, CE) 定序技术²。目前的趋势更是将 NGS 定序仪由房间般大小的巨型仪器缩小为桌上型 (benchtop) 系统，同时提高电脑运算和分析能力以因应日益增加的资讯量。随着 NGS 的普及，各种科学研究、临床医学、农牧养殖、甚至国安防恐的应用方案势必会陆续问世，但这些应用都会面临一项关键问题：NGS 的结果是否正确可靠？

NGS 的关键步骤需要品质把关

整个 NGS 过程大致可分为四个工作阶段，而各个工作阶段均需设置品管关卡 (checkpoint)，以确保最后的定序结果正确、可靠、并能作为决策依据。这四个工作阶段及其关卡包含¹：

取得样本核酸：定序需要从组织、细胞、或微生物等来源纯化并放大目标核酸。而进一步处理核酸样本前，应先针对其浓度、纯度、以及完整度执行品管。在进行第二个工作阶段前，必须精确测量核酸浓度，符合进样量需求才能进行建库之流程；纯度的测量在于样本若遭其他核酸或化学物质污染，则可能导致噪声过多或定序酵素之灵敏度与效率下降。此外，若核酸片段完整度不高，则会造成定序资讯不全或污染讯号无法分辨等情形。以上因素都将冲击定序结果和品质。
建置核酸片段库 (library)：待定序的样本须先经过物理或酵素处置，将核酸裁切为一定范围内的长度，再依 NGS 仪器或定序需求进行序列处理或标记。高品质的核酸片段库是 NGS 的成功关键。而重点品管指标则包含修饰/放大前后的片段长度分布、片段浓度、及片段总量等等。这是因为核酸在经过片段化、末端修饰、和放大后长度皆会改变，而 NGS 系统的设计乃针对特定长度范围内的核酸进行定序，太长或太短都会影响准确度，故须确定样本库核酸长度落在合适的范围，且无其他可能造成干扰的杂质片段。
锁定目标和片段放大：为提升 NGS 的效率，锁定最有兴趣的核酸区域并利用 PCR 放大核酸片段数量是必要步骤，但品管上亦须确认锁定的区域和放大的核酸片段是否正确，也需验证放大后的核酸片段浓度和完整度是否适当。
定序与资讯分析：实际定序和相关资讯分析将是决定成败的步骤，而撇除分析过程使用的算法、比对的数据库、及比对方式等资讯科学议题，最重要的品管关卡为验证定序结果的正确性。另外，很多NGS的应用都希望找到特定核酸变异 (variant) 以作为实验成功与否或后续用药选择的参考依据，而验证这些核酸变异是否确实存在也是重要品管关卡之一。

运用跨世代技术提升 NGS 的品质

在 NGS 系统提供大量定序资料的同时，NGS 样本的品质管理上，须建立简单、快速、经济的制度化方案，以验证样本的各种参数并确认片段大小。而目前符合上述条件的技术以两项为主：萤光定量、以及毛细管电泳技术 (capillary electrophoresis, CE)³。近年随着桌上型毛细管电泳仪的出现 (如 BiOptic Inc.的 Qsep 系列、Advanced Analytical Fragment Analyzer、或 Agilent Bioanalyzer)，CE 已成为位居幕后却在 NGS 前端把关的必备核心品管技术³。

究竟 CE 能在 NGS 品管扮演什么样的角色？

CE 是利用电泳原理将核酸片段进行分离，而由于整个过程都是在毛细管内进行，因此所需样本量很低，电泳时间也可缩短，但却能提供高于一般电泳数十倍的分辨率。基于此特性，CE 最常被用在下列 NGS 品管关卡：

分析样本核酸的完整度：纯化后的核酸可透过 CE 确认降解 (degradation) 情形，避免误用高度降解的核酸进行后续核酸片段库的建置。
进行样本核酸的定量：尽管核酸定量多使用萤光光谱分析技术，但“眼见为凭”仍有其品管价值，而 CE 的电泳结果图有助于确认实际核酸浓度和萤光光谱分析结果之间是否存在明显误差，尤其是确认核酸片段库是否有接合体双体 (adapter dimer) 存在，光靠定量是无法分辨，进而影响定序资料量。
分析核酸片段的长度分布：核酸片段库的制作过程需将样本核酸裁切为特定长度范围内的片段，并进行各种标记和处置以利后续定序。核酸片段库的建置相当费时费工，品质也会直接影响定序结果，因此一般都会在样本核酸裁切、末端修饰、锁定目标区域、及片段放大等步骤后用 CE 各执行一次片段长度分布分析，以确保核酸片段未过度降解、片段长度适中、无引子或其他标记的残留、且没有其他杂质或污染。在此同时也可确认片段长度分布落于定序仪的定序长度限制内，避免有定序不全或伪阴性结果出现。

NGS 品管的重要性：以临床肿瘤基因检测套组为例

目前有许多 NGS 肿瘤基因套组 (cancer panel) 用于检验肿瘤类型及特定基因变异的存在，可作为后续治疗选择的关键参考依据。若因伪阳性或伪阴性结果造成误判，轻则耽误治疗浪费时间和金钱，重则可能导致治疗失败和患者的死亡。以 NGS 肿瘤基因套组搭配 CE 定序品管将有助于减少误判情形，并确保医疗资源最有效率的应用。近期发表于美国临床科学家学会 (Association of Clinical Scientists, ACS) 会刊的急性骨髓性白血病 (acute myeloid leukemia, AML) 基因变异检测研究则提到，自动化 CE 片段分析仪可大幅提升检测通量和缩短检测时间，而该研究采用的桌上型 Qsep 分析仪 (Qsep 100) 另具突变性质分析功能，作者们认为相当符合区域级医疗机构的多元临床检测和品管需求⁴。

面对 NGS 的关键瓶颈，CE 的新思维可提供解套？

早在 2011 年，美国耶鲁大学的研究团队就预言，限制 NGS 发展的瓶颈不会是核酸定序技术或电脑运算能力，而是劳力密集的样本制备和品管作业⁵。该文点出最大的两项挑战将在：

流程：复杂而费时的品管流程会耽误 NGS 的作业，而相对于萤光定量 (如 PicoGreen 或 Qubit)，现有 CE 分析仪普遍准备步骤较繁琐。
成本：对于需处理大量样本的定序中心来说，高通量 CE 分析仪固然有助降低品管成本；但对于样本数相对较少的医疗机构、学研单位、或个别实验室，现有的仪器价格及单次检测费用都偏高，时常有凑样上机的困扰。

近期研究显示影响 NGS 定序品质最关键的品管关卡，在于样本核酸处理后和核酸片段库建置后所进行之核酸完整度和核酸长度分布检查⁶；也就是说若能提升现有的 CE 品管效能，对于 NGS 的品质升级和未来发展可能会有加成效果。目前，多数 CE 系统皆采多通道设计，但未能符合实际 NGS 建库与 QC 流程之需求。BiOptic Inc.的Qsep 系列分析仪即采用与过去有别之新思维，推出 Qsep 1、Qsep 100、Qsep 400 由小至大的多元通量选择，免除凑样上机的麻烦。系统建置不但符合经济效益，更以操作简单、随插即用卡匣式设计做为主要诉求，不仅有助于中小规模实验室设置品管关卡而提升检测品质的稳定性和可靠性，同时亦符合现在 NGS 技术走向桌上化、普及化、即时化的趋势。

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结语

目前 NGS 定序最热门的临床应用领域，是在侦测和定序液态生物检体 (liquid biopsy) 中浓度极低的游离细胞 DNA (cell-free DNA, cfDNA) 或循环肿瘤 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)。由于样品制备有其难度，加上总量十分稀少，因此多数检测 QC 流程只做到浓度测量而已。但这类低浓度的样本，若有 gDNA 或 carrier RNA 的污染，会影响有效定序资料之产出，甚者变异检出之灵敏度。此时更需倚赖高灵敏的 CE 片段分析作为品质管理的一环，确保 NGS 结果的稳定。在定序的通量和速度方面，NGS 虽然超越了第一代的毛细管电泳定序技术；但就 NGS 样本的品管和确效来说，仍需 CE 做样本完整性和长度分布的把关。CE 和 NGS 的相辅相成，堪称是跨世代技术竞合的发展典范。

【本文由：BiOptic Inc.和基智生物科技赞助】

参考文献：
1. van Dijk EL et al. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet 2014; 30:418-26.
2. Karger BL & Guttman A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis 2009; 30(Suppl 1):S196-S202.
3. Endrullat C et al. Standardization and quality management in next-generation sequencing. Appl Transl Genom 2016;10:2-9.
4. Trinh PL & Pham Y. Establishment of a Multiplex PCR-Based Procedure for Detection of Most Common Mutations in NPM1, FLT3 in Acute Myeloid Leukemia Patients. Ann Clin Lab Sci 2018; 48:35-9.
5. Sboner A et al. The real cost of sequencing: higher than you think! Genome Biol 2011; 12:125.
6. Nietsch R et al. The Role of Quality Control in Targeted Next-generation Sequencing Library Preparation. Genomics Proteomics Bioinformatics 2016; 14:200-6.

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