好的載體帶基因療法上天堂！2 大類型如何選擇？

基因療法是用健康基因取代問題基因的一種現代醫學技術，科學家們希望只需一劑注射來解決過去無法治療的疾病，且數十年來，基因編輯工具的進步也讓該領域突飛猛進，成為不少生技企業奮力角逐的新興市場。

上一篇文章了解過基因療法的緣起與起落後，接下來基因線上 GeneOnline 將解密基因療法的不同載體特色與傳遞機制，讓讀者迅速理解基因療法的面貌。

基因療法僅限於編輯體細胞

依照傳遞及作用標的的不同，基因療法可分成生殖細胞（germ cell）基因療法和體細胞（somatic cell）基因療法。前者將基因輸送至卵子、精子等生殖細胞；後者將基因傳遞至骨髓、血液、皮膚細胞等體細胞。目前，所有基因療法皆針對體細胞，這是因為編輯生殖細胞的基因會連同改變下一代人的基因體，而基於倫理道德考量，所以尚未有針對生殖細胞的基因療法出現。

另一方面，體細胞基因療法有 3 類，一是將基因傳遞至患者血液的活體（in vivo）療法，二是在實驗室編輯患者細胞的基因，再輸送回人體的體外（ex vivo）療法，最後則是直接讓基因進入目標器官或組織的原位（in situ）療法。

病毒載體：轉染效率高、可標靶特定細胞

基因療法採用病毒載體與非病毒載體等 2 種方式進行基因轉移（gene transfer）。

病毒載體是使用病毒入侵人體與擴散的特性進行基因轉移，但必須先去除病毒的自我複製機制與致病性，降低患者致病風險，即可作為該療法的載體使用；而病毒的轉導效率就決定了基因轉移的功效。

病毒載體有嵌入型載體（integrating vectors）與非嵌入型載體 2 種，前者如反轉錄病毒（retrovirus）、慢病毒（lentivirus）可以嵌入患者 DNA，後者如腺病毒（adenovirus）、腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）、疱疹單純型病毒（herpes simplex virus, HSV）則會成為游離 DNA（episomal DNA），保留在細胞核中。

而這 2 種載體的差別在於，游離載體不會在患者 DNA 中自行複製，也就是說，載體在細胞分裂後不會存在於子細胞，可在短時間內消失，這對追求轉殖基因短期表現的療法十分有用。

病毒載體中有 DNA 與 RNA 病毒之分。DNA 病毒載體已用於癌症、愛滋病、神經疾病、心血管疾病等多種臨床候選藥物中，舉凡腺病毒、AAV、HSV；而像是慢病毒等 RNA 病毒載體則被用於暫時表現（transient expression）轉殖基因，時下多用於愛滋病治療的臨床試驗。

好用的病毒載體有哪些標準？

判定一個病毒載體是否優秀，可從載量、基因表現時效、組織趨向（能感染的細胞類型和數目）與轉導效率來看。最重要的是，擁有低致病性與免疫原性，才不會在進入人體後引發嚴重的免疫反應。總體來說，AAV 病毒載體是目前主流的基因療法傳遞方式。

美國 FDA 已核准 2 款 AAV 基因療法，分別是 Novartis 治療脊髓性肌肉萎縮症（spinal muscular atrophy）的 Zolgensma（AAV9）與 Spark Therapeutics 治療萊伯氏先天性黑蒙症（leber congenital amaurosis）的 Luxturna（AAV2）。

此外還有多款 AAV 候選基因療法正於第 2/3 期臨床試驗，譬如 Pfizer 治療 A 型血友病的 SB-525（AAV6）、AskBio 治療 B 型血友病的 AskBio 009（AAV8）、Takeda 治療 A 型血友病的 TAK-754（AAV8）、Biogen 治療脈絡膜缺失症（choroideremia）的 timrepigene emparvovec（AAV2）、Homology Medicines 治療苯丙酮尿症（phenylketonuria）的 HMI-102（AAVHSC15）等。

非病毒載體：安全性高、量產門檻低、便宜

製造非病毒載體以裸露質體 DNA（naked plasmid DNA）與微脂體（liposome）為大宗。它們因擁有低免疫原性，比病毒載體更安全，價格上也因量產門檻低，所以更便宜。然而非病毒載體的轉染效率（transfection efficiency）並不高，且難以標靶特定細胞種類，同時也需大數量的載體才有辦法達到治療功效。

非病毒載體的基因傳遞機制

非病毒載體擁有多種傳遞方式。首先是微量注射（microinjection），這常用於製作基因轉殖小鼠上，但因為質體在核酸內切酶血清（serum endonucleases）中會迅速降解，也容易受胞內體陷套（endosomal entrapment）與腎臟清除作用（renal clearance）破壞，所以微量注射並非傳遞質體 DNA 的最佳方式。

二來是雷射治療、電穿孔（electroporation）與聲孔作用（sonoporation），利用輻射、電場和高密度超聲波，來增加標靶細胞的滲透性與攝取。第三是使用重金屬傳遞裸露 DNA 的基因槍（gene gun），最後是使用電場能量傳遞 DNA 奈米粒子的磁轉染系統（Magnetofection）。

基因編輯工具 CRISPR、ZFN、TALEN 的時代

基因編輯工具 ZFN、TALEN 與 CRISPR/Cas 的出現大幅增加了基因療法的治療範圍，也讓人類可直接編輯人體的基因缺陷。

相較傳統基因療法，CRISPR 不僅治療成本低、精準度高，也擁有相對低的執行門檻，主要由 AAV 載體傳遞。研究人員可把 Cas9 酶和導引 RNA 放入 DNA 質體載體，再裝入 AAV 即可使用；但 AAV 載體由於載量較低，所以仍有技術挑戰要解決。

CRISPR 基因療法還可將導引 RNA 放入能表現 Cas9 的細胞中進行傳遞，另外也有將 Cas9 的 N- 端與 C- 端放入 2 個 AAV 載體，並在轉染細胞時組合成可正常運作的 Cas9 進行治療。目前 CRISPR 基因療法的最新傳遞方式是使用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的小型 Cas9，這種方式較不佔據 AAV 載體的空間。

CRISPR 常用於活體外基因療法，舉凡 CRISPR Therapeutics 與 Vertex Pharmaceuticals 透過編輯造血幹細胞，共同開發的 β-地中海型貧血症與鐮刀型紅血球疾病（SCD）的 CRISPR 基因療法 CTX001。

另一方面，CRISPR 在治療杜氏肌肉萎縮症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）與遺傳性高酪胺酸血症（hereditary tyrosinemia）上會採用靜脈或針對特定組織注射的活體內治療方式，例如史上第 1 個直接注射於人體的基因療法，由 Editas Medicine 開發治療萊伯氏先天性黑蒙症的 EDIT-101 就是一例。