走過半世紀的基因定序 從研究技術蛻變成為產業支柱 (下)

週邊解決方案蓬勃發展 NGS臨床應用漸臻成熟

次世代基因定序目前最廣泛的臨床應用主要以母胎、生殖和腫瘤醫學的發展最為快速，但臨床生物檢體的複雜性相當高而且待側細胞/分子通常相當稀少，因此相對應的周邊解決方案也就應運而生，包括：

1. ctDNA的捕獲與擴增：ctDNA在人體非常微量，若要精準分辨它的存在與否甚至突變序列/位點，必須透過精準的捕獲(Capture)和擴增(Enrichment)技術來做定序前的樣本處理，並以足夠的深度(1000X以上）進行定序方能精準分析它的存在與否與突變序列/位點，是提升檢測品質的關鍵步驟。包括KAPA Biosystem(已被Roche併購）和Qiagen在內，有許多廠商陸續推出套裝試劑與解決方案。

2. 微量檢體的全基因體擴增(WGA):臨床上有一些微量細胞檢體的序列分析，例如：胚胎著床前染色體基因篩檢(PGS)，在每個胚胎僅能取得3-8顆細胞的情況下，必須透過全基因體擴增(WGA)的方法平均地提昇樣本的DNA質量，才能精準分析判斷胚胎是否帶有一些染色體異常或Copy Number Variation(CNV)。常見的試劑平台包括:AMPLI1(Silicon Biosystems)、MALBAC(Yikon Genomics)、Repli-G(Qiagen) 、PicoPlex(Rubicon)等。

3. 罕見細胞（Rare cell)或個別細胞（single cell)基因體定序: 人體內有一些游離的罕見細胞（例如：血液游離腫瘤細胞或孕婦血液中的胎兒有核紅血球細胞）或 一群白血球細胞當中不同的基因表現 需要進行單一或個別基因定序時，要使用第三代基因定序的建置成本相當高，因此有一些以NGS平台為基礎的解決方案，就成為相對經濟的選擇，例如：10X genenomics 透過   GemCode™的分子標記技術將個別細胞做標示進行NGS定序的前處理，經過套裝軟體的序列組裝之後，不僅能分析出個別細胞的序列/基因表現資訊，還能提升序列組裝的效率和精確率，近年也相當受到關注。

第三代基因定序（Non-PCR Sequencing）從研究走向應用

雖然次世代基因定序的數據輸出量與定序效能越來越強大，能在短時間內精確地分析大量的基因序列資訊，但因為其讀長較短（通常50~200bp），需要有參考序列或是繁雜的組裝演算（assembling algorithm）才能達到精準的結果。倘若遇到長片段的重複序列，或是全新物種的基因序列，就容易增加NGS定序錯誤的機率，因此第三代定序需求也就應運而生。第三代測序技術又稱為單分子 DNA 測序，是通過現代光學、高分子、納米技術等手段來區分鹼基信號差異的原理，以達到直接讀取序列信息的目的，所謂的第三代定序是指不需要透過PCR擴增放大的過程，直接對單一條長片段的DNA進行的基因定序，由於單一片段的DNA定序讀長較長，可以大幅減少序列組裝的複雜性，也較能夠判斷基因體中的高重複性序列的正確性，尤其在一些全新物種的基因體分析研究最能展現出它的優勢。但是，也就因為第三代定序只針對單一的DNA分子進行定序，不像NGS能夠以增加定序深度(Sequencing Depth)來提昇定序的品質，因此仍然具有較高的錯誤率（5~30%），主要應用在一些植物和微生物的新物種基因序列分析或是容易發生甲基化的高重複性基因序列(CpG island)，目前多用於研究用途，尚未出現成熟的臨床應用(有部分研究將三代基因定序應用於HLA-genotyping)。

延伸閱讀：走過半世紀的基因定序 從研究技術蛻變成為產業支柱 (上)

第三代定序比較具有代表性的平台包括較早期的Helicos Bioscience的tSMS (True Single Molecule Sequencing) 、Pacific Bioscience的SMRT(Single Molecule Real-Time sequencing)、Helicos和後期異軍突起的Oxford Nanopore Technologies。

Helicos BioSciences是由史丹佛大學的Stephen Quake教授創立，率先在2008年發表了tSMS (True Single Molecule Sequencing)的定序系統，強調能夠直接定序單一的DNA分子（不需要進行PCR擴增反應），開啟了第三代定序的時代。tSMS (True Single Molecule Sequencing)是將待測DNA片段單股化之後接上poly-A序列以固定於定序晶片表面，再透過與四種dNTP的DNA聚合反應與四種螢光訊號的偵測來進行定序。但由於其方法相較於同期的NGS定序成本過高，且讀長(30~35bp)過短，無法被市場廣泛接受，導致公司無法順利持續營運，於2012年宣告破產告終。後來他們分別將技術授權給予美國的SeqLL公司和中國的賀建奎教授創立的瀚海基因（Direct Genomics）。瀚海基因以Helicos Biosciences的技術為基礎，生產了第一部由中國製造的第三代定序儀-Genocare，並於2017年運用其平台將大腸桿菌的基因體定序完成。

Pacific Bioscience的SMRT(Single Molecule Real-Time sequencing)技術是將DNA聚合酶固定於底部透明的皮米小孔槽（picoliter well/zero mode waveguides(ZMW)），剛好能讓一條DNA序列在孔槽內進行DNA聚合反應，並使用將ATCG分別以四種顏色螢光標定的核苷酸作為光學偵測訊號，即能依序定序出每一孔槽內的單一DNA序列，平均讀長可以達到30kb以上，每一次定序的數據輸出量則有50Gb。Pacific Bioscience在2010年發表旗下第一部量產的三代定序儀-PacBio RS，往後2013年與2015年又陸續推出PacBio RSII和 Sequel System，成為目前三代定序最主要的技術平台。Pacific Bioscience由於其三代定序儀設備昂貴、定序成本高而且體積較為龐大，加上三代定序多用於研究用途，未有成熟的商業化或臨床應用，市場規模受到限制，在缺乏資金持續挹注的情況之下，於2018年被Illumina公司以12億美金收購。

Oxford Nanopore Technologies則是採用電泳技術，藉助電泳驅動單一條DNA分子穿過細小的奈米孔洞，偵測紀錄ATCG四種鹼基帶有不同的電位訊號來達到定序的目的。這樣的定序方法，不需要精密的光學成像系統來偵測螢光訊號，只需要偵測電位訊號，因此不僅大幅節省儀器的建置成本，體積也相對輕巧許多，甚至能達到可攜帶式的行動化定序儀。2015年5月，Oxford Nanopore Technologies發表了第一款可由USB電源驅動的行動化定序儀-MinION，雖然僅能產生10–20 Gb/48Hr的數據量，但它的讀長可達到230-300 kb，而且僅需要將樣本做簡單前處理就能上機分析，對於一些在野外做新物種調查的研究學者來說相當實用。後續Oxford Nanopore Technologies又推出數款不同通量的三代定序設備Flongle、PromethION、GridION X5，其中最高通量的GridION X5體積僅有家用印表機的大小，可達到50-100Gb的定序數據輸出量，未來有可能還會發展出直接連結手機就能進行基因定序的微型三代定序設備，相當值得關注。

基因定序技術的發明至今已經超過30年的時間，從第一代的Sanger定序、第二代的次世代定序（NGS）發展到第三代的單一分子定序(Single molecule sequencing/non-PCR sequencing)，基因定序效能的成長速率進展已經超越半導體的摩爾定律(Moore`s rule)，在臨床以及商業化的應用也已逐漸蓬勃。

然而，各個世代的基因定序技術，都有其不可取代性。Sanger定序由於精準度和穩定性非常高，依然是目前基因定序和診斷的黃金標準，主要的用途在於特定基因突變/遺傳疾病的診斷。而次世代定序的優勢在於強大的定序效能，能夠同時定序數百萬個基因片段，並透過生物資訊的演算方法進行拼接，適合發展大範圍的廣泛性篩檢，目前最成熟而廣泛的應用莫過於非侵入性胎兒染色體基因檢測(NIPT/NIFTY/NIPS)，還有針對單基因遺傳疾病和遺傳性癌症的廣泛性帶因篩檢(Expand Carrier Screening)，甚至是全外顯子定序(Whole Exon Sequencing ;WES)和全基因體定序(Whole Genome Sequencing; WGS)，都非常適合採用次世代定序的技術平台。

儘管，第三代定序目前雖然技術上已漸趨穩定，但由於定序成本仍然偏高，目前多僅只用於需要精準解讀長片段重複序列的研究用途（動物、植物、微生物的新物種de novo定序）和表觀遺傳學(Epigenetics) 的基因修飾（例如：甲基化）研究。現在，三代定序也已經開始朝向輕量化與平價化發展，未來很有機會能發展出許多的臨床或商業用途，例如藉由三代定序的單一分子特性，能夠直接針對單一細胞（Circulating Fetal Cell或 Circulating Tumor Cell）進行定序，不僅快速、方便，還能避免DNA經過PCR而產生的錯誤，非常有潛力發展出非侵入性胎兒染色體染色體基因/診斷(NIPD)或體內游離罕見細胞（癌細胞）的基因診斷。

未來的第四代定序，將可能朝向直接在組織內進行定序(In situ sequencing)的方法進行，將有助於更加了解組織微環境的變化，目前已經有人提出可行的方法學研究，但目前仍未有商業化的設備或儀器發表，後續的發展值得持續關注。

基因定序產業的持續創新和突破，需要長期的研發和資金挹注，許多掌握先進技術的新創公司或研發單位，由於缺乏穩定的資金來源和全球性的銷售通路，即便其技術具有利基市場，但通常無法持續微笑走到最後，因此在基因產業界的垂直或水平整合的併購案屢見不鮮。反觀掌握龐大資源的跨國大企業，透過併購能夠快速切入嶄新的技術領域和利基市場，將既有的行銷資源和銷售通路做有效率的運用，通常較有機會成功達到經濟規模，進而產生大者恆大的產業型態。基因科技產業相較於資通訊與科技金融服務產業，確實較難在短期內誕生快速雄霸一方的獨角獸企業，但由於精準醫療（Precision Medicine）崛起和許多商業化基因檢測應用的需求與日俱增，產業規模的未來成長仍然非常值得期待。

撰文/ John Hung

參考資料：
Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402Nat Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-51.
Comparison of Next-Generation Sequencing Systems. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:251364.
Sequencing a Single Molecule of DNA. https://www.technologyreview.com/s/410333/sequencing-a-single-molecule-of-dna/
In situ sequencing. Nature Methods volume 11, page 29 (2014)
Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-51.

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