走过半世纪的基因定序 从研究技术蜕变成为产业支柱 (下)

周边解决方案蓬勃发展 NGS临床应用渐臻成熟

次世代基因定序目前最广泛的临床应用主要以母胎、生殖和肿瘤医学的发展最为快速，但临床生物检体的复杂性相当高而且待侧细胞/分子通常相当稀少，因此相对应的周边解决方案也就应运而生，包括：

1. ctDNA的捕获与扩增：ctDNA在人体非常微量，若要精准分辨它的存在与否甚至突变序列/位点，必须透过精准的捕获(Capture)和扩增(Enrichment)技术来做定序前的样本处理，并以足够的深度(1000X以上）进行定序方能精准分析它的存在与否与突变序列/位点，是提升检测品质的关键步骤。包括KAPA Biosystem(已被Roche并购）和Qiagen在内，有许多厂商陆续推出套装试剂与解决方案。

2. 微量检体的全基因体扩增(WGA):临床上有一些微量细胞检体的序列分析，例如：胚胎着床前染色体基因筛检(PGS)，在每个胚胎仅能取得3-8颗细胞的情况下，必须透过全基因体扩增(WGA)的方法平均地提升样本的DNA质量，才能精准分析判断胚胎是否带有一些染色体异常或Copy Number Variation(CNV)。常见的试剂平台包括:AMPLI1(Silicon Biosystems)、MALBAC(Yikon Genomics)、Repli-G(Qiagen) 、PicoPlex(Rubicon)等。

3. 罕见细胞（Rare cell)或个别细胞（single cell)基因体定序: 人体内有一些游离的罕见细胞（例如：血液游离肿瘤细胞或孕妇血液中的胎儿有核红血球细胞）或 一群白血球细胞当中不同的基因表现 需要进行单一或个别基因定序时，要使用第三代基因定序的建置成本相当高，因此有一些以NGS平台为基础的解决方案，就成为相对经济的选择，例如：10X genenomics 透过   GemCode™的分子标记技术将个别细胞做标示进行NGS定序的前处理，经过套装软件的序列组装之后，不仅能分析出个别细胞的序列/基因表现资讯，还能提升序列组装的效率和精确率，近年也相当受到关注。

第三代基因定序（Non-PCR Sequencing）从研究走向应用

虽然次世代基因定序的数据输出量与定序效能越来越强大，能在短时间内精确地分析大量的基因序列资讯，但因为其读长较短（通常50~200bp），需要有参考序列或是繁杂的组装演算（assembling algorithm）才能达到精准的结果。倘若遇到长片段的重复序列，或是全新物种的基因序列，就容易增加NGS定序错误的机率，因此第三代定序需求也就应运而生。第三代测序技术又称为单分子 DNA 测序，是通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的，所谓的第三代定序是指不需要透过PCR扩增放大的过程，直接对单一条长片段的DNA进行的基因定序，由于单一片段的DNA定序读长较长，可以大幅减少序列组装的复杂性，也较能够判断基因体中的高重复性序列的正确性，尤其在一些全新物种的基因体分析研究最能展现出它的优势。但是，也就因为第三代定序只针对单一的DNA分子进行定序，不像NGS能够以增加定序深度(Sequencing Depth)来提升定序的品质，因此仍然具有较高的错误率（5~30%），主要应用在一些植物和微生物的新物种基因序列分析或是容易发生甲基化的高重复性基因序列(CpG island)，目前多用于研究用途，尚未出现成熟的临床应用(有部分研究将三代基因定序应用于HLA-genotyping)。

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第三代定序比较具有代表性的平台包括较早期的Helicos Bioscience的tSMS (True Single Molecule Sequencing) 、Pacific Bioscience的SMRT(Single Molecule Real-Time sequencing)、Helicos和后期异军突起的Oxford Nanopore Technologies。

Helicos BioSciences是由史丹佛大学的Stephen Quake教授创立，率先在2008年发表了tSMS (True Single Molecule Sequencing)的定序系统，强调能够直接定序单一的DNA分子（不需要进行PCR扩增反应），开启了第三代定序的时代。tSMS (True Single Molecule Sequencing)是将待测DNA片段单股化之后接上poly-A序列以固定于定序芯片表面，再透过与四种dNTP的DNA聚合反应与四种萤光讯号的侦测来进行定序。但由于其方法相较于同期的NGS定序成本过高，且读长(30~35bp)过短，无法被市场广泛接受，导致公司无法顺利持续营运，于2012年宣告破产告终。后来他们分别将技术授权给予美国的SeqLL公司和中国的贺建奎教授创立的瀚海基因（Direct Genomics）。瀚海基因以Helicos Biosciences的技术为基础，生产了第一部由中国制造的第三代定序仪-Genocare，并于2017年运用其平台将大肠杆菌的基因体定序完成。

Pacific Bioscience的SMRT(Single Molecule Real-Time sequencing)技术是将DNA聚合酶固定于底部透明的皮米小孔槽（picoliter well/zero mode waveguides(ZMW)），刚好能让一条DNA序列在孔槽内进行DNA聚合反应，并使用将ATCG分别以四种颜色萤光标定的核苷酸作为光学侦测讯号，即能依序定序出每一孔槽内的单一DNA序列，平均读长可以达到30kb以上，每一次定序的数据输出量则有50Gb。Pacific Bioscience在2010年发表旗下第一部量产的三代定序仪-PacBio RS，往后2013年与2015年又陆续推出PacBio RSII和 Sequel System，成为目前三代定序最主要的技术平台。Pacific Bioscience由于其三代定序仪设备昂贵、定序成本高而且体积较为庞大，加上三代定序多用于研究用途，未有成熟的商业化或临床应用，市场规模受到限制，在缺乏资金持续挹注的情况之下，于2018年被Illumina公司以12亿美金收购。

Oxford Nanopore Technologies则是采用电泳技术，借助电泳驱动单一条DNA分子穿过细小的奈米孔洞，侦测纪录ATCG四种碱基带有不同的电位讯号来达到定序的目的。这样的定序方法，不需要精密的光学成像系统来侦测萤光讯号，只需要侦测电位讯号，因此不仅大幅节省仪器的建置成本，体积也相对轻巧许多，甚至能达到可携带式的行动化定序仪。2015年5月，Oxford Nanopore Technologies发表了第一款可由USB电源驱动的行动化定序仪-MinION，虽然仅能产生10–20 Gb/48Hr的数据量，但它的读长可达到230-300 kb，而且仅需要将样本做简单前处理就能上机分析，对于一些在野外做新物种调查的研究学者来说相当实用。后续Oxford Nanopore Technologies又推出数款不同通量的三代定序设备Flongle、PromethION、GridION X5，其中最高通量的GridION X5体积仅有家用打印机的大小，可达到50-100Gb的定序数据输出量，未来有可能还会发展出直接连结手机就能进行基因定序的微型三代定序设备，相当值得关注。

基因定序技术的发明至今已经超过30年的时间，从第一代的Sanger定序、第二代的次世代定序（NGS）发展到第三代的单一分子定序(Single molecule sequencing/non-PCR sequencing)，基因定序效能的成长速率进展已经超越半导体的摩尔定律(Moore`s rule)，在临床以及商业化的应用也已逐渐蓬勃。

然而，各个世代的基因定序技术，都有其不可取代性。Sanger定序由于精准度和稳定性非常高，依然是目前基因定序和诊断的黄金标准，主要的用途在于特定基因突变/遗传疾病的诊断。而次世代定序的优势在于强大的定序效能，能够同时定序数百万个基因片段，并透过生物资讯的演算方法进行拼接，适合发展大范围的广泛性筛检，目前最成熟而广泛的应用莫过于非侵入性胎儿染色体基因检测(NIPT/NIFTY/NIPS)，还有针对单基因遗传疾病和遗传性癌症的广泛性带因筛检(Expand Carrier Screening)，甚至是全外显子定序(Whole Exon Sequencing ;WES)和全基因体定序(Whole Genome Sequencing; WGS)，都非常适合采用次世代定序的技术平台。

尽管，第三代定序目前虽然技术上已渐趋稳定，但由于定序成本仍然偏高，目前多仅只用于需要精准解读长片段重复序列的研究用途（动物、植物、微生物的新物种de novo定序）和表观遗传学(Epigenetics) 的基因修饰（例如：甲基化）研究。现在，三代定序也已经开始朝向轻量化与平价化发展，未来很有机会能发展出许多的临床或商业用途，例如借由三代定序的单一分子特性，能够直接针对单一细胞（Circulating Fetal Cell或 Circulating Tumor Cell）进行定序，不仅快速、方便，还能避免DNA经过PCR而产生的错误，非常有潜力发展出非侵入性胎儿染色体染色体基因/诊断(NIPD)或体内游离罕见细胞（癌细胞）的基因诊断。

未来的第四代定序，将可能朝向直接在组织内进行定序(In situ sequencing)的方法进行，将有助于更加了解组织微环境的变化，目前已经有人提出可行的方法学研究，但目前仍未有商业化的设备或仪器发表，后续的发展值得持续关注。

基因定序产业的持续创新和突破，需要长期的研发和资金挹注，许多掌握先进技术的新创公司或研发单位，由于缺乏稳定的资金来源和全球性的销售通路，即便其技术具有利基市场，但通常无法持续微笑走到最后，因此在基因产业界的垂直或水平整合的并购案屡见不鲜。反观掌握庞大资源的跨国大企业，透过并购能够快速切入崭新的技术领域和利基市场，将既有的行销资源和销售通路做有效率的运用，通常较有机会成功达到经济规模，进而产生大者恒大的产业型态。基因科技产业相较于资通讯与科技金融服务产业，确实较难在短期内诞生快速雄霸一方的独角兽企业，但由于精准医疗（Precision Medicine）崛起和许多商业化基因检测应用的需求与日俱增，产业规模的未来成长仍然非常值得期待。

撰文/ John Hung

参考资料：
Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402Nat Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-51.
Comparison of Next-Generation Sequencing Systems. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:251364.
Sequencing a Single Molecule of DNA. https://www.technologyreview.com/s/410333/sequencing-a-single-molecule-of-dna/
In situ sequencing. Nature Methods volume 11, page 29 (2014)
Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-51.

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