走過半世紀的基因定序從研究技術蛻變成為產業支柱 (上)

基因定序發明人類科技發展史新頁

1977年，英國劍橋大學的科學家-弗雷德里克·桑格(Frederick Sanger)博士發明了雙脫氧鏈終止法（Dideoxy chain-termination method），運用四種ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP）隨機造成DNA序列的複製終止，形成不同長度的DNA片段，採用四種不同顏色（紅、黃、藍、綠）的螢光做專一性標定，將這些不同長度的DNA片段在獨立的通道進行DNA電泳，雙維比對這些DNA片段的長短和螢光顏色的關聯，就能依序解碼出這段DNA片段的組成和順序（序列），準確率相當高，也不需要複雜的運算分析，是最早發展成熟的第一代基因定序技術，又稱桑格定序法（Sanger Sequencing），這個劃時代的發明不僅讓桑格博士在1980年二度獲得諾貝爾化學獎的殊榮，更為1980年代提出解碼人類基因的人類基因體計畫（Human Genome Project）奠定重要基礎。

人類基因體計畫揭開自動化定序的序幕

1980年代，美國政府開始規劃推動人類基因體計畫（HGP），由詹姆士·華生（James Watson）和法蘭西斯·柯林斯(Francis Collins)接棒領軍，開始著手解碼人類基因體。1990年，人類基因組計劃由美國能源部和國家衛生研究院投資，預期在15年內完成。隨後，該計劃擴展為國際合作的計劃，英國、日本、法國、德國、中國和印度先後加入

在國際人類基因組計劃（以下簡稱「國際計劃」）啟動八年後的1998年，美國科學家克萊格·凡特創辦了一家名為塞雷拉基因組（Celera Genomics）的私立公司，邀聘具基因定序之父美名的台灣華裔生物學家陳奕雄（Ellson Chen）博士擔任首席科學家，開展獨立的人類基因組計劃。陳奕雄博士的團隊採用了更快速同時更具風險的技術全基因組霰彈槍測序，並用毛細管電泳的方法，進而開發出ABI 3700全自動高速定序儀。自動化定序的發明，讓美國政府得以在2001年宣布提早完成人類基因定序草圖，也為日後發展蓬勃的基因檢測技術奠定了重要的基礎。

延伸閱讀：2000年06月26日美國總統柯林頓宣布第一個人類全基因組完成定序

次世代基因定序（NGS）蓬勃發展基因定序產業的戰國時代

次世代定序又稱為大量平行定序（Massively Parallel Sequencing, MPS），是建構在一代定序的基礎上開發出的新技術，藉由同時間大量的短序列片段（Short Reads）定序達成高速以及高通量的效果。次世代基因定序（NGS）主要有SOLiD、Ion Torrent(Life Technologies)、454、Solexa、Complete Genomics這幾種技術平台。

SOLiD定序是將DNA打斷成50bp左右的短片段，透過油滴包覆的方式進行DNA片段的放大反應（emulsion PCR）和重複的ligation反應，達到高準確度的優點，但也因為讀長較短而使得定序的效率降低，需要7~14天才能完成一輪定序反應，而且需要強大的電腦運算才能完成數據分析，使用上較為侷限，後期在市場發展上就逐漸式微。

454 生命科學公司（454 Bioscience）於 2005 年推出以焦磷酸定序（pyrosequencing）為基礎的技術平台，是將待測的DNA序列切成 1,000 個鹼基長左右的大片段，再將這些片段與特殊珠料結合，每一個珠子上只會有一種片段。接下來，每個珠子將會被分到微量盤上的獨立凹槽進行片段複製作業（emulsion PCR）。完成複製後，微量盤則會加滿同一種鹼基，而這些鹼基與 DNA 序列結合後就會釋放光訊號讓電腦可讀取序列。但此方法的缺點是遇到單一種核苷酸的重複序列時，準確率會大幅降低，而在定序成本上又明顯比其他的技術平台昂貴。在始終無法取的市場優勢的情況之下，2016年母公司羅氏診斷(Roche)宣布停止供應454定序平台的相關試劑，正式退出市場。

Applied Biosystem和Invitrogen共同成立的Life Technologies，採用的則是截然不同的半導體定序方法(技術授權來自DNA Electronics Ltd)，將建庫和PCR完成的待測DNA序列透過adapter均勻連結在微球體(beads)上，而半導體晶片上有數以百萬計的微小孔槽（孔徑剛好只能容納一個beads），其定序原理是透過DNA聚合酶反應，當dNTP和待測序列產生互補結合時，會釋放出一個氫離子(H+)讓孔槽內的pH值和電位產生變化，透過孔槽底部的感應元件，就能即時記錄4種dNTP合成的排序，進而定序出待測DNA序列。Life Technologies的定序技術平台捨棄了昂貴的螢光影像系統，透過半導體偵測微小的電位訊號，不僅能快速完成定序，也具有定序成本較低的優勢，與illumina成為全球市占率前二大的NGS定序系統（約25~30%）。Life Technologies在2013年宣布被Thermo Fisher Scientific以136億美元的天價收購，2015年起就以Thermo Fisher Scientific的品牌直接進行定序設備的生產與銷售。

延伸閱讀：走過半世紀的基因定序從研究技術蛻變成為產業支柱 (下)

Solexa定序方法是將DNA打斷成150~300bp的片段，雙端再各接上一段adapter序列，透過橋式聚合酶鏈鎖反應進行增幅，將不同鹼基且標記特定可移除螢光分子的dNTP與反應試劑，重覆進行螢光標記移除與偵測，在定序晶片上同時對數百萬條DNA進行反應，以達到快速且大量的定序結果。2007年，Illumina買下了Solexa，並在2009年以Solexa的技術基礎推出自有品牌的Illumina Hiseq高通量定序儀（600Gb/run），雖然單一base的定序成本較其他平台便宜，但因為讀長短，需要3~10天才能完成一輪定序反應。Illumina後續也針對不同的市場需求推出高通量 (NextSeq 500, HiSeq series 2500, 3000, and 4000, and HiSeq X series five and ten) (120–1500 GDNA nanoball sequencingb)和小通量（Ｍiseq）中低通量的定序儀（0.3 to 15 Gb ），給予使用者較靈活的選擇和較為方便的數據分析解決方案，成為現今全球市場佔有率將近70%的優勢品牌。

Complete Genomics (CG)的NGS定序系統是採用DNA nanoball sequencing的方法，將待測DNA序列單股化與環化(Circulation)成為單股環狀DNA，再透過環狀擴增將單股環狀DNA序列複製成超長鏈的單股DNA進而形成DNA奈米球的結構，DNA奈米球在定序晶片上會排列成微陣列的型態（晶片上的短片段核苷酸可將DNA奈米球固定於晶片上形成陣列），再透過DNA聚合反應與螢光標定的偵測進行定序。2013年，在基因定序領域野心勃勃的華大基因（BGI）併購了Complete Genomics (CG)，並於2015年公開發表宣稱全球第一部中國製造、搭載中文操作介面的桌上型高通量定序儀-BGISEQ-500。其性能與定序資訊輸出量則介於Illumina的主力機種Nextseq-500(120GB/run)和Hiseq 2500(1500GB/run)之間，因應不同的研究用途與臨床檢測樣本需求，可彈性使用兩種規格的流體晶片，彈性選擇定序的資訊輸出量與定序的直接成本，並在 2016 年 10 月獲得中國國家食品藥品監督管理總局 (CFDA) 核准臨床使用，主要應用於大批量的非侵入性胎兒染色體基因檢測(NIPT/NIFTY/NIPS)。2017～2018年，華大基因旗下的華大智造（MGI）又發表了中、高通量和超高通量的NGS定序儀 MGISEQ-200、MGISEQ-2000和MGISEQ-T7，積極地在NGS的發展企圖與Thermo Fisher (Ion Torrent)和Illumina一爭崢嶸。

德國生物科技大廠Qiagen，在次世代基因定序（NGS）領域也沒有缺席，2012年收購了Intelligent BioSystems公司的 CRT 技術平台，採用的是邊複製合成邊定序（Sequencing by synthesis）的方法，原理與Solexa（Illumina）類似，但Qiagen是以磁珠方法將特定序列進行擴增，而Illumina則是在定序晶片上採取橋式PCR的方式進行擴增，還是有些許不同。2015年，Qiagen正式發表旗下第一部NGS平台儀器-GeneReader，訴求從樣本到資訊分析整個流程都能在此平台完成，針對12個主要的癌症基因推出套裝方案，提供臨床研究更簡便的流程。但因為其NGS平台的應用有限，市場佔有率並不高。由於檢體樣本製備和後端的資訊分析攸關NGS基因定序資料品質好壞與成敗，在NGS儀器無法佔有優勢的情況下，Qiagen的產品佈局轉而著重在發展NGS定序前後的週邊解決方案和試劑開發，在基因科技產業鏈當中仍然扮演著關鍵的角色。