走过半世纪的基因定序从研究技术蜕变成为产业支柱 (上)

基因定序发明人类科技发展史新页

1977年，英国剑桥大学的科学家-弗雷德里克·桑格(Frederick Sanger)博士发明了双脱氧链终止法（Dideoxy chain-termination method），运用四种ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP）随机造成DNA序列的复制终止，形成不同长度的DNA片段，采用四种不同颜色（红、黄、蓝、绿）的萤光做专一性标定，将这些不同长度的DNA片段在独立的通道进行DNA电泳，双维比对这些DNA片段的长短和萤光颜色的关联，就能依序解码出这段DNA片段的组成和顺序（序列），准确率相当高，也不需要复杂的运算分析，是最早发展成熟的第一代基因定序技术，又称桑格定序法（Sanger Sequencing），这个划时代的发明不仅让桑格博士在1980年二度获得诺贝尔化学奖的殊荣，更为1980年代提出解码人类基因的人类基因体计画（Human Genome Project）奠定重要基础。

人类基因体计画揭开自动化定序的序幕

1980年代，美国政府开始规划推动人类基因体计画（HGP），由詹姆士·华生（James Watson）和法兰西斯·柯林斯(Francis Collins)接棒领军，开始着手解码人类基因体。1990年，人类基因组计划由美国能源部和国家卫生研究院投资，预期在15年内完成。随后，该计划扩展为国际合作的计划，英国、日本、法国、德国、中国和印度先后加入

在国际人类基因组计划（以下简称“国际计划”）启动八年后的1998年，美国科学家克莱格·凡特创办了一家名为塞雷拉基因组（Celera Genomics）的私立公司，邀聘具基因定序之父美名的台湾华裔生物学家陈奕雄（Ellson Chen）博士担任首席科学家，开展独立的人类基因组计划。陈奕雄博士的团队采用了更快速同时更具风险的技术全基因组霰弹枪测序，并用毛细管电泳的方法，进而开发出ABI 3700全自动高速定序仪。自动化定序的发明，让美国政府得以在2001年宣布提早完成人类基因定序草图，也为日后发展蓬勃的基因检测技术奠定了重要的基础。

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次世代基因定序（NGS）蓬勃发展基因定序产业的战国时代

次世代定序又称为大量平行定序（Massively Parallel Sequencing, MPS），是建构在一代定序的基础上开发出的新技术，借由同时间大量的短序列片段（Short Reads）定序达成高速以及高通量的效果。次世代基因定序（NGS）主要有SOLiD、Ion Torrent(Life Technologies)、454、Solexa、Complete Genomics这几种技术平台。

SOLiD定序是将DNA打断成50bp左右的短片段，透过油滴包覆的方式进行DNA片段的放大反应（emulsion PCR）和重复的ligation反应，达到高准确度的优点，但也因为读长较短而使得定序的效率降低，需要7~14天才能完成一轮定序反应，而且需要强大的电脑运算才能完成数据分析，使用上较为侷限，后期在市场发展上就逐渐式微。

454 生命科学公司（454 Bioscience）于 2005 年推出以焦磷酸定序（pyrosequencing）为基础的技术平台，是将待测的DNA序列切成 1,000 个碱基长左右的大片段，再将这些片段与特殊珠料结合，每一个珠子上只会有一种片段。接下来，每个珠子将会被分到微量盘上的独立凹槽进行片段复制作业（emulsion PCR）。完成复制后，微量盘则会加满同一种碱基，而这些碱基与 DNA 序列结合后就会释放光讯号让电脑可读取序列。但此方法的缺点是遇到单一种核苷酸的重复序列时，准确率会大幅降低，而在定序成本上又明显比其他的技术平台昂贵。在始终无法取的市场优势的情况之下，2016年母公司罗氏诊断(Roche)宣布停止供应454定序平台的相关试剂，正式退出市场。

Applied Biosystem和Invitrogen共同成立的Life Technologies，采用的则是截然不同的半导体定序方法(技术授权来自DNA Electronics Ltd)，将建库和PCR完成的待测DNA序列透过adapter均匀连结在微球体(beads)上，而半导体芯片上有数以百万计的微小孔槽（孔径刚好只能容纳一个beads），其定序原理是透过DNA聚合酶反应，当dNTP和待测序列产生互补结合时，会释放出一个氢离子(H+)让孔槽内的pH值和电位产生变化，透过孔槽底部的感应元件，就能即时记录4种dNTP合成的排序，进而定序出待测DNA序列。Life Technologies的定序技术平台舍弃了昂贵的萤光影像系统，透过半导体侦测微小的电位讯号，不仅能快速完成定序，也具有定序成本较低的优势，与illumina成为全球市占率前二大的NGS定序系统（约25~30%）。Life Technologies在2013年宣布被Thermo Fisher Scientific以136亿美元的天价收购，2015年起就以Thermo Fisher Scientific的品牌直接进行定序设备的生产与销售。

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Solexa定序方法是将DNA打断成150~300bp的片段，双端再各接上一段adapter序列，透过桥式聚合酶链锁反应进行增幅，将不同碱基且标记特定可移除萤光分子的dNTP与反应试剂，重复进行萤光标记移除与侦测，在定序芯片上同时对数百万条DNA进行反应，以达到快速且大量的定序结果。2007年，Illumina买下了Solexa，并在2009年以Solexa的技术基础推出自有品牌的Illumina Hiseq高通量定序仪（600Gb/run），虽然单一base的定序成本较其他平台便宜，但因为读长短，需要3~10天才能完成一轮定序反应。Illumina后续也针对不同的市场需求推出高通量 (NextSeq 500, HiSeq series 2500, 3000, and 4000, and HiSeq X series five and ten) (120–1500 GDNA nanoball sequencingb)和小通量（Ｍiseq）中低通量的定序仪（0.3 to 15 Gb ），给予使用者较灵活的选择和较为方便的数据分析解决方案，成为现今全球市场占有率将近70%的优势品牌。

Complete Genomics (CG)的NGS定序系统是采用DNA nanoball sequencing的方法，将待测DNA序列单股化与环化(Circulation)成为单股环状DNA，再透过环状扩增将单股环状DNA序列复制成超长链的单股DNA进而形成DNA奈米球的结构，DNA奈米球在定序芯片上会排列成微阵列的型态（芯片上的短片段核苷酸可将DNA奈米球固定于芯片上形成阵列），再透过DNA聚合反应与萤光标定的侦测进行定序。2013年，在基因定序领域野心勃勃的华大基因（BGI）并购了Complete Genomics (CG)，并于2015年公开发表宣称全球第一部中国制造、搭载中文操作接口的桌上型高通量定序仪-BGISEQ-500。其性能与定序资讯输出量则介于Illumina的主力机种Nextseq-500(120GB/run)和Hiseq 2500(1500GB/run)之间，因应不同的研究用途与临床检测样本需求，可弹性使用两种规格的流体芯片，弹性选择定序的资讯输出量与定序的直接成本，并在 2016 年 10 月获得中国国家食品药品监督管理总局 (CFDA) 核准临床使用，主要应用于大批量的非侵入性胎儿染色体基因检测(NIPT/NIFTY/NIPS)。2017～2018年，华大基因旗下的华大智造（MGI）又发表了中、高通量和超高通量的NGS定序仪 MGISEQ-200、MGISEQ-2000和MGISEQ-T7，积极地在NGS的发展企图与Thermo Fisher (Ion Torrent)和Illumina一争峥嵘。

德国生物科技大厂Qiagen，在次世代基因定序（NGS）领域也没有缺席，2012年收购了Intelligent BioSystems公司的 CRT 技术平台，采用的是边复制合成边定序（Sequencing by synthesis）的方法，原理与Solexa（Illumina）类似，但Qiagen是以磁珠方法将特定序列进行扩增，而Illumina则是在定序芯片上采取桥式PCR的方式进行扩增，还是有些许不同。2015年，Qiagen正式发表旗下第一部NGS平台仪器-GeneReader，诉求从样本到资讯分析整个流程都能在此平台完成，针对12个主要的癌症基因推出套装方案，提供临床研究更简便的流程。但因为其NGS平台的应用有限，市场占有率并不高。由于检体样本制备和后端的资讯分析攸关NGS基因定序资料品质好坏与成败，在NGS仪器无法占有优势的情况下，Qiagen的产品布局转而着重在发展NGS定序前后的周边解决方案和试剂开发，在基因科技产业链当中仍然扮演着关键的角色。