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預測下一個生技世代的風貌(二): CRISPR 的積極進取

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有了基因體、蛋白質體資訊可尋找突變基因和即時觀察各種蛋白質的表現,讓研究人員更能掌握生物體的運作及更有效地找出各種病原與異常。但最後一道關卡長期以來難以突破,就是:發現問題之後該怎麼辦?過去面對基因突變,頂多只能用 RNA 干擾嘗試抑制基因表現,但既無法確保所有細胞的突變基因都被抑制,也無法改善基因突變後導致蛋白質無法表現的相關病症。對於折疊或修飾失敗的蛋白質 (如狂牛病的 Prion) 只能用抗體加以捕捉或小分子藥物進行抑制,但仍無法改變造成錯誤的根本機制。不過,這一切隨著 CRISPR 技術出現,正逐漸展露曙光。目前已有 CRISPR-Cas9 用於治療乙型 (β) 地中海型貧血、鐮刀型貧血等血液遺傳疾病的研究;甚至針對各種癌症,以及愛滋病病毒 (HIV)、人類乳突病毒 (HPV) 等,也都找到 CRISPR 可介入的方向並積極投入研究當中。

認識 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)

所謂 CRISPR,是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (群聚且有規律間隔的短回文重複序列) 之縮寫,最早在 1987 年由日本研究員石野良純等人在大腸桿菌中發現。到了 2002 年,歐美研究人員更進一步發現一系列與 CRISPR 相關的 Cas (CRISPR-associated genes) 基因,並證明這些基因轉譯出的 Cas 蛋白是具有剪輯 DNA 功能的核酸酶。CRISPR 能辨識特定的 DNA 序列,且 Cas 酵素具有剪輯 DNA 的作用,讓基因編輯術突飛猛進。過去受限於編輯工具無法準確定位,但 CRISPR 技術問世後,研究人員得以針對特定片段或基因進行置換。例如,若想剔除某一致癌基因,可先針對周邊 DNA 序列設計互補的 RNA 片段,然後插入人工 CRISPR 系統。接著將 CRISPR 系統與現在最常用的 Cas9 核酸酶導入目標細胞,人工 RNA 片段即會找到可互補的 DNA 區段進行配對,接著誘導 Cas9 針對特定位置剪輯 DNA。如此一來便可大幅提升成功率,避免切錯位置導致的後遺症。

以 CRISPR 客製基因剔除細胞株

過去只能用 RNA 干擾技術嘗試抑制基因表現,但現在可將人工設計的 CRISPR-Cas9 質體轉染 (transfection) 至目標細胞,便可從源頭在特定 DNA 序列位置刪除或加入所需基因。如果搭配報導質體 (surrogate reporter,轉染成功會表現出螢光、抗藥性、或特定基因),就能更有效篩選被剔除或加入特定基因的單株細胞,大大提升實驗細胞株的製作效率及品質。另外,CRISPR 可利用於一一剔除細胞內的基因以個別分析其功能,而若將被剔除單種基因的單株細胞組成完整之細胞庫 (library),屆時想研究什麼基因只須像上圖書館借書般從細胞庫選出對應的細胞即可,既簡單又直觀!台灣生技公司如圖爾思生物科技也提供細胞株,動物基因編輯的客製化服務。

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延伸閱讀:預測下一個生技世代的風貌(一):NGS次世代定序的見微知著

以 CRISPR 客製實驗動物

實驗動物如老鼠及斑馬魚是生醫研究和新藥開發的重要角色,而透過 CRISPR-Cas9 技術誘發特定基因表現,便可針對不同狀況模擬相應的生物體環境。隨著新技術發展,Cas9 重組蛋白可以直接打入胚胎,省去從質體 (plasmid) 轉錄、轉譯蛋白質的過程,並大幅增加誘導式多能性幹細胞 (induced pluripotent stem cell, iPSC) 以及纖維母細胞 (fibroblast) 等不易進行基因編輯的細胞之轉染成功率。故相較於傳統胚胎幹細胞選殖,CRISPR 可大幅縮短基改動物的製造時程,甚至能跨越物種限制,例如將人類基因嵌入小鼠基因體進行表現。

日新月異的 CRISPR 工具

最基本的 CRISPR-Cas9 系統已經廣泛運用於分子生物學研究,但臨床應用仍有許多障礙,這包含:

  1. Cas9 酵素由 Cas9 蛋白質與 guide RNA (gRNA) 組成,而 gRNA 包含與目標基因互補的 crRNA 及和 Cas9 蛋白質結合的 tracRNA。因此 Cas9 蛋白質須先與 gRNA 結合,作用於目標基因後才會啟動剪輯功能。
  2. Cas9 剪輯目標基因後,會留下鈍端 (blunt end),也就是 DNA 序列直接被平整切斷,不利將修正好的 DNA 序列換置到目標基因原來的位置。
  3. Cas9 有明確的切點,但如果這個切點發生突變,CRISPR-Cas9 就會失效。
  4. 誤切目標基因以外的位置,通稱為「脫靶效應」,可能導致嚴重後果甚至引發癌症。

有鑑於此,當前科學家也積極在發掘各種效率和功能更先進的 CRISPR 模組。例如最新的 CRISPR-Cpf1,其功能與 Cas9 類似,但卻擁有幾個優點,例如:更容易送入細胞和組織、Cpf1 僅需搭配一段 RNA 進行配對即可剪輯、還能在剪輯後留下方便置換新 DNA 序列的黏端 (sticky end)、以及更重要的是 Cpf1 所辨識的序列離切點有一段距離,因此即使切點發生突變,Cpf1 的功能仍不受影響。

另外針對脫靶效應,科學家也透過誘發 Cas9 基因在特定位置發生突變以改變 Cas9 蛋白的帶電性質。DNA 是帶負電,Cas9 蛋白質和 DNA 結合的位置為正電,因此如果可以把某些帶正電的氨基酸換成中性,來降低對預設目標以外位置的親合力,將可減少脫靶效應的發生率。實驗結果發現 3 個胺基酸的突變可以大幅減低脫靶效應,這個新的蛋白質稱為 eSpCas9。而圖爾思科技也成功開發及提供 eSpCas9 protein 與 cpf-1 protein。

近期中國科學家韓春雨教授發表新的基因編輯工具 NgAgo 蛋白,是透過 DNA 進行誘導的新興技術 (不同於 Cas9 蛋白以 RNA 進行誘導),比起 Cas9 來說有靈活性更高(不需要以 PAM 辨識)、體積較小 (適用更小的病毒載體)、脫靶率可能較低等優點,且賴以誘導的 DNA 較 RNA 更容易合成,並在細胞內更能保持穩定。不過目前全世界都有科學家正在測試及重複 NgAgo 的活性與再現性,似乎都認為 NgAgo 的效率不如想像中的好,但韓春雨教授也公佈他詳細的實驗方法和注意事項讓大家檢驗,所以或許 NgAgo 這個工具要發展成熟還需要點時間。

除此之外,科學家亦努力發掘其他 CRISPR 相關酵素,未來可望建立完整的工具箱,視對象、目的、細胞類型、或目標基因組合出最佳的 CRISPR 系統進行操作。

影片分享:
你知道當前最熱門的生物技術有哪些嗎 ? 由周士軒博士談 NGS、CRISPR 的趨勢、新的研究發現,以及在轉譯醫學、臨床治療上的應用。歡迎點閱:
Trends in Biotools- Translating NGS and CRISPR into Biological Fields – 周士軒 博士
http://pics.ee/DVe

延伸閱讀:基因編輯工具CRISPR的新剪刀: Cpf1

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