基因检测:对食物中微生物进行户口调查

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美国疾病管制与预防中心 (CDC) 的资料显示,食源性疾病造成美国每年约 4,800 万人生病,128,000 人住院,甚至有 3,000 人因此死亡 [注 1]。在台湾,2001–2010 年平均每年有 285 起食源性疾病爆发,明显较 1991–2000 年间每年平均 143 起为多,可见其严重程度随着社会与经济进步其实有增无减,大大威胁著民众的饮食健康 [注 2]。

食源性疾病可由食物中所含的微生物或其毒素引发。在美国,诺罗病毒 (norovirus) 是引起最多疾病的病原体,而细菌则是导致住院或死亡之主因 [注 3]。食物中的病原体之传统筛检方法以“分离培养”和“生物化学检测”为主,但因为敏感度低且需大量的时间和人力,目前已跟不上日益严重的食品卫生查验需求。取而代之的是近年突飞猛进的核酸分析方法,其敏感性高、时间短、自动化程度较高的特性,已使核酸分析成为现在侦测病原体的主要工具。

核酸分析法的演进

核酸分析法可直接侦测病原体的 DNA 或 RNA 序列,最早的做法是针对病原体的独特基因序列设计引子 (primer),再针对食物样本进行 PCR,看看能不能结合并放大目标基因以证明有该病原体的存在,最后再用胶体电泳检视 PCR 的结果。不过这种方法的敏感度不高,也相当费时费力,因此研究人员努力设法改良。后续也成功开发可同时复制数个基因的多重 PCR (multiple PCR),可提高敏感性并一次侦测多种病原体;或是能够直接在 PCR 反应槽侦测成果,不须另外进行胶体电泳的即时定量 PCR (real-time quantitative PCR) ;还有可侦测 RNA 基因体之核酸序列扩增法 (nucleic acid sequence based amplification, NASBA) [注 4]。

NASBA 乃以反转录酵素制造 RNA 的互补 DNA,再以互补 DNA 为模板复制出 RNA,并且透过不断循环来大量扩增病原体 RNA。此法最主要的优点是可在固定温度下运作 (通常为 41°C) 而降低器材复杂度,且后续发展出的即时 NASBA 也让使用者能够第一时间得到检测成果。即时 NASBA 甚至还可判断食物中是否含有存活的病原体细胞 [注 5],更扩大了其应用范围。

在 2000 年,Notomi 等人提出同样在单一温度下即可大量复制 DNA 的圈环形核酸增幅法 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP) [注 6]。LAMP 所用的 DNA 聚合酶能一边解开双股 DNA 一边进行复制,再加上特殊设计的两对 (或三对) 引子具有相近之黏合温度,使其能在单一温度即发生连锁反应,快速放大目标 DNA。此法通常只须 35-60 分钟即可得到结果,且因不需复杂的温度控制仪器,加上可用 magnesium pyrophosphate 产生沉淀 [注 7] 或 SYBR Green I 萤光显色 [注 8] 等肉眼可见的方法进行判读,故很适合用于田间筛检、小规模实验室、缺乏物资的偏远地区、或大规模检疫工作等,极富应用价值。

图示:李斯特菌(Listeria monocytogenes)

图示:李斯特菌(Listeria monocytogenes)

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未来食物检验的趋势

随着食物品项和新发现之致病微生物的增加,检验方法之精准度、速度与自动化皆须进一步提升。可同时快速侦测数百个目标基因片段的寡核甘酸 DNA 微阵列已广泛用于筛检食物中的病原体,但因为制程特殊且价格昂贵,对于规模较小的机构较不符成本效益。不过全基因体定序发展至今,人类基因体定序的费用已降至 1,000 美元左右;而细菌基因体长度只有人类的千分之一,许多商业平台提供的单一菌种定序服务现在不到 50 美元,且 5 天内可完成。全基因体还有另一项优势,就是可针对致病病原体进行亚型分析 (subtyping),能更有效鉴别食物中的菌株是否就是造成疫情的病原体。

以 2014 年在美国发生的凝乳起司事件为例,美国佛州的 Oasis Brands 在 2014 年 8 月主动回收其凝乳起司产品,因为怀疑受到李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 的污染。两个月后,美国食品药物管理局 (FDA) 主动查验 Oasis Brands 的起士厂房,并从采集的样品中找到李斯特菌,于是要求该公司回收可能受到污染的产品并关闭厂房。

在完成病原体的全基因体定序后,FDA 进一步发现回收的凝乳起司之李斯特菌基因体与近期从五位感染李斯特菌的患者所分离出的菌株相似。尽管这五位患者发病的时间和地点皆不相同,但后来得知他们都是拉丁裔美国人,且在近期有吃过凝乳起司,只是忘记吃的是什么品牌。

FDA 随即利用基因体定序资讯要求餐厅及零售商停止贩卖相关产品,同时建议消费者避免食用相关的起司与乳制品 [注 9],不仅在问题扩大前成功防堵,亦有助于受害者求偿。上述案例显示全基因体定序在分析食物病原体确实拥有相当大的优势。未来这些先进核酸分析技术将会搭配次世代定序与总体基因体学数据库,不但可用以检测食物中常见的病原体,也能够找出更多未知但可能致病的微生物,确实为大众的饮食安全把关。

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参考文献:
1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). CDC Estimates of Foodborne Illness in the United States. 2011. Available online at: http://www.cdc.gov/foodborneburden/PDFs/FACTSHEET_A_FINDINGS_updated4-13.pdf
2. Chen WJ et al. J Food Drug Anal 2013; 21:261-7
3. Scallan E et al. Emerg Infect Dis 2011; 17:7-15.
4. Compton J. Nature 1991; 350:91-2.
5. Simpkins SA et al. Lett Appl Microbiol 2000; 30:75-9.
6. Notomi T et al. J Microbiol 2015; 53:1-5.
7. Mori Y et al. Biochem Biophys Res Commun 2001; 289:150-4.
8. Njiru ZK et al. PLoS Negl Trop Dis 2008; 2:e147.
9. http://www.cdc.gov/listeria/outbreaks/cheese-10-14/index.html