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見微知菌—利用基因體定序尋找未知微生物

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研究顯示,地球上約存在一兆種以上的微生物,目前還發現不到百分之的物種一 [註 1]。但那些未知的物種不一定只存在於難以到達的高壓深海或是灼熱火山中,它們很可能正在眼前的滑鼠鍵盤以及您身體的裡裡外外開心過活,只是我們還沒有發現而已……

從培養皿到核酸定序:見微知著功力的提升

傳統研究微生物的方法多是以分離培養得到單一物種的方式來探究其特性,但是未知微生物往往因生長條件不明而無法培養。研究人員之前也利用 16S rRNA 基因廣泛存在於幾乎所有生物,但序列會隨不同物種而有若干變異的特性,針對 16S rRNA 基因設計各種共同引子定序樣本中的 16S rRNA 基因,如此一來便能得知樣本是否包含新物種 [註 2]。不過這樣的方法雖然比分離培養有更高的敏感性,但因為只針對一種基因進行分析,故僅可發現新物種的存在,無法理解其構造或生理功能。

總體基因體學:拼圖遊戲

隨著定序技術的進步,科學家已可利用總體基因體學 (metagenomics) 工具同時對樣本中數不清的微生物進行定序,得到龐大的片段資訊後再與資料庫比對,進而拼湊出個別物種的基因體。總體基因體學最大的優點是能夠在毫無頭緒的情況下揪出來源不明的基因並循線發掘新種微生物,亦能補足只靠定序 16s rRNA 所缺少的其他基因資訊。目前各地的研究團隊已用此方法發現上千種過去無法培養的新菌種,著名例子包括從人類口腔 [註 3] 及土壤 [註 4] 發現的 TM7、同樣也在口腔發現的 SR-1 [註 5]、附著於水槽水管內的 TM6 [註 6]、來自無含氧泉水的 OP11 [註 7]、以及存在於溫泉底部堆積物的 OP9 等 [註 8]。不過定序方法也存在一大缺點,因為從一個樣本定序出來的結果可能包含成千上萬種微生物所貢獻的上兆種基因片段,故必須花費大量時間及人力建構基因資料庫並設計可比對及拼組基因片段的程式才能得到有意義之結果,挑戰性依然很高。

單細胞定序:鎖定目標

為了更精確分析單一種類微生物的基因體,研究人員致力於減少定序所需的細胞數,到現在甚至只要一顆細胞便能定序。現在已經能以細胞分類技術分離出單一細胞後,再使用 MDA (multiple displacement amplification,MDA) 或 MALBAC (multiple annealing and looping-based amplification cycles) 等方法進行定序。

MDA reaction steps,來源:https://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_displacement_amplification

MDA reaction steps,來源:https://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_displacement_amplification

延伸閱讀:基因檢測:對食物中微生物進行戶口調查

MDA 技術和一般 PCR 的不同點在於其引子為隨機六碼核苷酸,故幾乎能從任意位置開始複製;其特殊 Phi 29 核酸聚合酶在複製過程中,亦可將所遇到的其他複製片段從模板 DNA 剝離後繼續前進,而分離出來的片段又會被引子接上並展開另一次複製與分離,週而復始形成大量分支狀 DNA。經過多次循環達到目標數量後,便能用 S1 核酸酶切斷分支處形成無分支 DNA,再進行後續定序工作。其優點為基因體覆蓋率高 (單一人類細胞可達 99% [註 9]),但因經常遺漏對偶基因 (allelic dropout) 且引子間容易發生交互作用,故判讀結果時須特別留心。

MALBAC 則藉由設計特殊引子,使第二輪複製成品頭尾相接成環而無法再做為模板進行下一次複製,進而改善傳統複製過程容易延續上一次錯誤的情形,讓成品更能貼近原始 DNA 序列。MALBAC 經過特殊引子複製五輪後,會用一般引子進行傳統 PCR 增加片段總數,再定出完整序列。與 MDA 相比,MALBAC 的基因體覆蓋率在單一細胞雖較低 (單一人類細胞約 93% [註 10]),且因前五輪所用之複製酶出錯率稍微較高,故往往須 2-3 顆細胞以上才能獲得最精確的成果;但由於偵測突變的偽陽性與偽陰性率低、不易遺漏對偶基因、以及偵測單核苷酸多型性 (SNP) 效率較高的優點,與 MDA 各有千秋。而且得到初步基因體序列後,其實就能回頭與總體基因體多頭定序得到的諸多片段進行比對,拼湊出其完整度和正確度甚高的 DNA 藍圖。

由此即可推估未知微生物的構造、生命運作機制、以及與周遭環境的互動關係,或進而發掘富有潛力的抗生素、抗癌藥、及具有應用價值之化學物質等。在 99% 的未知物種當中,想必存在許多極富運用價值的基因或蛋白質。一想到還有那麼多未知領域等待發掘,您的探究精神是否也跟著燃燒起來了呢?

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參考文獻:
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3. Marcy Y et al. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104:11889-94.
4. Podar M et al. Appl Environ Microbiol 2007; 73:3205-14.
5. Campbell JH et al. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110:5540-5.
6. McLean JS et al. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110:E2390-9.
7. Youssef NH et al. Appl Environ Microbiol 2011; 77:7804-14.
8. Dodsworth JA et al. Nat Commun 2013; 4:1854.
9. Paez JG et al. Nucleic Acids Res 2004; 32:e71.
10. Zong C et al. Science 2012; 338:1622-6.
11. Ling LL et al. Nature 2015; 517:455-9.

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