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單細胞定序 不需進行全基因組增幅

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『加拿大英屬哥倫比亞大學(University of British Columbia)的團隊意識到單細胞定序技術的限制,致力於革新定序流程,研發出直接樣本庫製備法(direct library preparation,DLP),省略全基因組增幅的步驟,排除增幅過程所造成的技術與人為偏誤,而且比以往使用的方式更精準可信。』

單細胞定序 真實反映細胞的獨特性

單細胞定序(single-cell sequencing)技術在 2013 年時,被《Nature Methods》期刊選為年度技術,這項技術突破了基因定序的應用,過去通常使用組織樣本或細胞群進行 DNA 與 RNA 序列分析,透過分析運算樣本細胞群取得平均值,但是這樣的方式往往無法看到細胞個體的特性。

為了真實反映每個細胞的獨特性,科學家分離出單一細胞,從中萃取遺傳物質,再以全基因組增幅(whole-genome amplification,WGA)技術製造足量遺傳物質以進行分析,單細胞基因體(single-cell genomics)被解碼之後,更揭示了細胞個體的異質性(heterogeneity),應用於癌細胞的研究,可以更精確的了解單一癌細胞的基因體以及結構變化,更能偵測罕見的細胞變異,這項技術在其他領域如:微生物學、免疫學、神經生物學、胚胎發育學、組織嵌合(tissue mosaicism)以及產前診斷都有長足貢獻。

精益求精 現行技術仍有限制

儘管單細胞定序的應用令人振奮,但仍有許多技術上的限制有待改良,其中以 WGA 為例,這是造成偏誤的主要步驟之一,因為要符合現有的定序技術,科學家必須將單一細胞基因體複製放大,以產生足夠的遺傳物質製備分析樣本庫(library preparation),常見的 WGA 技術有:DOP-PCR(degenerate oligonucleotide-primed PCR)、MDA(multiple displacement amplification)以及 MALBAC(multiple annealing and looping based amplification Cycles),各種增幅技術都有適用的情況,但不論何種方式都很難避免技術偏差,對偶基因若有異型合子的突變(heterozygous mutation),該基因無法透過聚合反應增幅而造成對偶基因丟失(allelic dropout,ADO),變異基因的偽陰性或偽陽性,聚合酶鏈鎖反應所使用的引子(primer)品質會影響增幅基因組的覆蓋率(coverage),覆蓋率不足、不一致的覆蓋率等偏誤(圖一)都使單細胞的基因序列無法被真實呈現。

圖一 單細胞序列分析常見的偏誤(a)對偶基因丟失、偽陽性或是偽陰性而造成覆蓋率不,其中 Pop 指細胞群體(a population of cell)(b)覆蓋率的度量包含覆蓋深度(coverage depth)以及總物理覆蓋率(total physical coverage),也就是覆蓋廣度(coverage breadth)(c)覆蓋一致性(coverage uniformity)隨著不同細胞而有差異。

圖一 單細胞序列分析常見的偏誤(a)對偶基因丟失、偽陽性或是偽陰性而造成覆蓋率不,其中 Pop 指細胞群體(a population of cell)(b)覆蓋率的度量包含覆蓋深度(coverage depth)以及總物理覆蓋率(total physical coverage),也就是覆蓋廣度(coverage breadth)(c)覆蓋一致性(coverage uniformity)隨著不同細胞而有差異。

延伸閱讀:挑戰百元基因定序 Illumina 推出新機種 NovaSeq

UBC 團隊的新技術 不需全基因組增幅

加拿大英屬哥倫比亞大學的團隊意識到 WGA 技術的限制,致力於革新單細胞定序的程序,在今年一月正式於《Nature Methods》發表新的研究成果,使用直接樣本庫製備法(direct library preparation,DLP),省略了 WGA 的步驟,不進行前置增幅(preamplification),排除基因增幅過程中所產生的技術與人為偏誤,而且比以往使用的方式更精準可信。

科學家設計了一組 192 孔的微流體裝置(圖二),這套系統使用奈生(nanoliter)作為單為容積,可以直接針對單一細胞進行樣本庫製備,除了利用極微量的容積提高分析的解析度之外,可充氣的微流體分析盤能夠隨著不同的實驗需求而變化容積大小,同時還有內建的標記引子(incorporated index primers),可以直接標記單一細胞,此外獨立的影像系統讓研究人員能清楚的觀察細胞樣本。

圖二 192 孔微流體裝置示意圖

圖二 192 孔微流體裝置示意圖

技術前景無可限量

高解析度的分析設備搭配改良的運算流程,研究團隊分析癌細胞株,將個別單細胞定序結果以電腦模擬匯合,模擬大量基因體分析的結果,得出相當一致的覆蓋率,同時更精確的偵測癌細胞的基因複製數改變(copy-number alterations,CNAs),大幅提升單細胞異質性的偵測,相較於現行的技術,新技術的花費與舊法相當,但是科學家有機會從中獲得更多資訊,讓單細胞定序的應用更有價值。

研究的主持人 Carl Hansen 博士表示,已將新技術的專利註冊並為 AbCellera 所有,AbCellera 是 Hansen 博士所領導的生技公司,主要致力單株抗體療法(monoclonal antibody therapeutics),雖然 DLP 技術與 AbCellera 的發展關聯性較低,Hansen 也因此規劃成立新公司發展商品化 DLP,不過 Hansen 相信未來可以將技術延伸應用於免疫療法,使更多人受惠於革新的技術。

文 / Joanne Shih

延伸閱讀:美國擬嚴管基改動物 基因編輯的兩難

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參考文獻:
1."Method Of The Year 2013″. Nature Methods 11.1 (2013): 1-1
2.Zahn, Hans et al. “Scalable Whole-Genome Single-Cell Library Preparation Without Preamplification". Nature Methods 14.2 (2017): 167-173
3.Gawad, Charles, Winston Koh, and Stephen R. Quake. “Single-Cell Genome Sequencing: Current State Of The Science". Nature Reviews Genetics 17.3 (2016): 175-188
4.Molika Ashford. “UBC group debuts single-cell sequencing method without whole genome amplification". Genomeweb (2017)
5.Navin, Nicholas E. “Cancer Genomics: One Cell At A Time". Genome Biology 15.8 (2014)

圖片來源:
1.http://en.novogene.com/wp-content/uploads/2015/10/single-cell-RNA.png
2.Gawad, Charles, Winston Koh, and Stephen R. Quake. “Single-Cell Genome Sequencing: Current State Of The Science". Nature Reviews Genetics 17.3 (2016): 175-188
3.Zahn, Hans et al. “Scalable Whole-Genome Single-Cell Library Preparation Without Preamplification". Nature Methods 14.2 (2017): 167-173

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