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次世代定序之跨世代競合:究竟毛細管電泳於 NGS 扮演什麼關鍵角色?

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人類全基因體定序首度於 2003 年完成解碼,共耗時 13 年;自此至今,估計有超過五十萬人的全基因體完成定序,現今最先進的定序儀,甚至能在短短 2 天內同時完成 48 人的全基因體定序。定序速度會如此突飛猛進,完全仰賴次世代定序 (next-generation sequencing, NGS) 技術,讓大量核酸片段可同步進行定序1,通量上大幅超越第一代的毛細管電泳 (capillary electrophoresis, CE) 定序技術2。目前的趨勢更是將 NGS 定序儀由房間般大小的巨型儀器縮小為桌上型 (benchtop) 系統,同時提高電腦運算和分析能力以因應日益增加的資訊量。隨著 NGS 的普及,各種科學研究、臨床醫學、農牧養殖、甚至國安防恐的應用方案勢必會陸續問世,但這些應用都會面臨一項關鍵問題:NGS 的結果是否正確可靠?

NGS 的關鍵步驟需要品質把關

整個 NGS 過程大致可分為四個工作階段,而各個工作階段均需設置品管關卡 (checkpoint),以確保最後的定序結果正確、可靠、並能作為決策依據。這四個工作階段及其關卡包含1

  • 取得樣本核酸:定序需要從組織、細胞、或微生物等來源純化並放大目標核酸。而進一步處理核酸樣本前,應先針對其濃度、純度、以及完整度執行品管。在進行第二個工作階段前,必須精確測量核酸濃度,符合進樣量需求才能進行建庫之流程;純度的測量在於樣本若遭其他核酸或化學物質污染,則可能導致雜訊過多或定序酵素之靈敏度與效率下降。此外,若核酸片段完整度不高,則會造成定序資訊不全或污染訊號無法分辨等情形。以上因素都將衝擊定序結果和品質。
  • 建置核酸片段庫 (library):待定序的樣本須先經過物理或酵素處置,將核酸裁切為一定範圍內的長度,再依 NGS 儀器或定序需求進行序列處理或標記。高品質的核酸片段庫是 NGS 的成功關鍵。而重點品管指標則包含修飾/放大前後的片段長度分布、片段濃度、及片段總量等等。這是因為核酸在經過片段化、末端修飾、和放大後長度皆會改變,而 NGS 系統的設計乃針對特定長度範圍內的核酸進行定序,太長或太短都會影響準確度,故須確定樣本庫核酸長度落在合適的範圍,且無其他可能造成干擾的雜質片段。
  • 鎖定目標和片段放大:為提升 NGS 的效率,鎖定最有興趣的核酸區域並利用 PCR 放大核酸片段數量是必要步驟,但品管上亦須確認鎖定的區域和放大的核酸片段是否正確,也需驗證放大後的核酸片段濃度和完整度是否適當。
  • 定序與資訊分析:實際定序和相關資訊分析將是決定成敗的步驟,而撇除分析過程使用的演算法、比對的資料庫、及比對方式等資訊科學議題,最重要的品管關卡為驗證定序結果的正確性。另外,很多NGS的應用都希望找到特定核酸變異 (variant) 以作為實驗成功與否或後續用藥選擇的參考依據,而驗證這些核酸變異是否確實存在也是重要品管關卡之一。

運用跨世代技術提升 NGS 的品質

在 NGS 系統提供大量定序資料的同時,NGS 樣本的品質管理上,須建立簡單、快速、經濟的制度化方案,以驗證樣本的各種參數並確認片段大小。而目前符合上述條件的技術以兩項為主:螢光定量、以及毛細管電泳技術 (capillary electrophoresis, CE)3。近年隨著桌上型毛細管電泳儀的出現 (如 BiOptic Inc.的 Qsep 系列、Advanced Analytical Fragment Analyzer、或 Agilent Bioanalyzer),CE 已成為位居幕後卻在 NGS 前端把關的必備核心品管技術3

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究竟 CE 能在 NGS 品管扮演什麼樣的角色?

CE 是利用電泳原理將核酸片段進行分離,而由於整個過程都是在毛細管內進行,因此所需樣本量很低,電泳時間也可縮短,但卻能提供高於一般電泳數十倍的解析度。基於此特性,CE 最常被用在下列 NGS 品管關卡:

  • 分析樣本核酸的完整度:純化後的核酸可透過 CE 確認降解 (degradation) 情形,避免誤用高度降解的核酸進行後續核酸片段庫的建置。
  • 進行樣本核酸的定量:儘管核酸定量多使用螢光光譜分析技術,但「眼見為憑」仍有其品管價值,而 CE 的電泳結果圖有助於確認實際核酸濃度和螢光光譜分析結果之間是否存在明顯誤差,尤其是確認核酸片段庫是否有接合體雙體 (adapter dimer) 存在,光靠定量是無法分辨,進而影響定序資料量。
  • 分析核酸片段的長度分布:核酸片段庫的製作過程需將樣本核酸裁切為特定長度範圍內的片段,並進行各種標記和處置以利後續定序。核酸片段庫的建置相當費時費工,品質也會直接影響定序結果,因此一般都會在樣本核酸裁切、末端修飾、鎖定目標區域、及片段放大等步驟後用 CE 各執行一次片段長度分布分析,以確保核酸片段未過度降解、片段長度適中、無引子或其他標記的殘留、且沒有其他雜質或污染。在此同時也可確認片段長度分布落於定序儀的定序長度限制內,避免有定序不全或偽陰性結果出現。

NGS 品管的重要性:以臨床腫瘤基因檢測套組為例

目前有許多 NGS 腫瘤基因套組 (cancer panel) 用於檢驗腫瘤類型及特定基因變異的存在,可作為後續治療選擇的關鍵參考依據。若因偽陽性或偽陰性結果造成誤判,輕則耽誤治療浪費時間和金錢,重則可能導致治療失敗和患者的死亡。以 NGS 腫瘤基因套組搭配 CE 定序品管將有助於減少誤判情形,並確保醫療資源最有效率的應用。近期發表於美國臨床科學家學會 (Association of Clinical Scientists, ACS) 會刊的急性骨髓性白血病 (acute myeloid leukemia, AML) 基因變異檢測研究則提到,自動化 CE 片段分析儀可大幅提升檢測通量和縮短檢測時間,而該研究採用的桌上型 Qsep 分析儀 (Qsep 100) 另具突變性質分析功能,作者們認為相當符合區域級醫療機構的多元臨床檢測和品管需求4

面對 NGS 的關鍵瓶頸,CE 的新思維可提供解套?

早在 2011 年,美國耶魯大學的研究團隊就預言,限制 NGS 發展的瓶頸不會是核酸定序技術或電腦運算能力,而是勞力密集的樣本製備和品管作業5。該文點出最大的兩項挑戰將在:

  • 流程:複雜而費時的品管流程會耽誤 NGS 的作業,而相對於螢光定量 (如 PicoGreen 或 Qubit),現有 CE 分析儀普遍準備步驟較繁瑣。
  • 成本:對於需處理大量樣本的定序中心來說,高通量 CE 分析儀固然有助降低品管成本;但對於樣本數相對較少的醫療機構、學研單位、或個別實驗室,現有的儀器價格及單次檢測費用都偏高,時常有湊樣上機的困擾。

近期研究顯示影響 NGS 定序品質最關鍵的品管關卡,在於樣本核酸處理後和核酸片段庫建置後所進行之核酸完整度和核酸長度分布檢查6;也就是說若能提升現有的 CE 品管效能,對於 NGS 的品質升級和未來發展可能會有加成效果。目前,多數 CE 系統皆採多通道設計,但未能符合實際 NGS 建庫與 QC 流程之需求。BiOptic Inc.的Qsep 系列分析儀即採用與過去有別之新思維,推出 Qsep 1、Qsep 100、Qsep 400 由小至大的多元通量選擇,免除湊樣上機的麻煩。系統建置不但符合經濟效益,更以操作簡單、隨插即用卡匣式設計做為主要訴求,不僅有助於中小規模實驗室設置品管關卡而提升檢測品質的穩定性和可靠性,同時亦符合現在 NGS 技術走向桌上化、普及化、即時化的趨勢。

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結語

目前 NGS 定序最熱門的臨床應用領域,是在偵測和定序液態生物檢體 (liquid biopsy) 中濃度極低的游離細胞 DNA  (cell-free DNA, cfDNA) 或循環腫瘤 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)。由於樣品製備有其難度,加上總量十分稀少,因此多數檢測 QC 流程只做到濃度測量而已。但這類低濃度的樣本,若有 gDNA 或 carrier RNA 的污染,會影響有效定序資料之產出,甚者變異檢出之靈敏度。此時更需倚賴高靈敏的 CE 片段分析作為品質管理的一環,確保 NGS 結果的穩定。在定序的通量和速度方面,NGS 雖然超越了第一代的毛細管電泳定序技術;但就 NGS 樣本的品管和確效來說,仍需 CE 做樣本完整性和長度分布的把關。CE 和 NGS 的相輔相成,堪稱是跨世代技術競合的發展典範。

【本文由:BiOptic Inc.和基智生物科技贊助】

參考文獻:
1. van Dijk EL et al. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet 2014; 30:418-26.
2. Karger BL & Guttman A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis 2009; 30(Suppl 1):S196-S202.
3. Endrullat C et al. Standardization and quality management in next-generation sequencing. Appl Transl Genom 2016;10:2-9.
4. Trinh PL & Pham Y. Establishment of a Multiplex PCR-Based Procedure for Detection of Most Common Mutations in NPM1, FLT3 in Acute Myeloid Leukemia Patients. Ann Clin Lab Sci 2018; 48:35-9.
5. Sboner A et al. The real cost of sequencing: higher than you think! Genome Biol 2011; 12:125.
6. Nietsch R et al. The Role of Quality Control in Targeted Next-generation Sequencing Library Preparation. Genomics Proteomics Bioinformatics 2016; 14:200-6.

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