根除瘧疾有望!科學家找到生存關鍵基因

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南佛里達大學(University of South Florida)的研究團隊利用惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)特殊的基因特性創造了 38,000 個突變株,並確定 2,680 個以上影響存活的必須基因,未來可望幫助研究人員篩選抗瘧疾藥物之新標的,相關研究成果已於 5 月 4 日發表於《Science》期刊。

在醫藥發達的 21 世紀,惡性瘧原蟲引起的瘧疾仍普遍存在於赤道周圍的熱帶及亞熱帶國家,每年多達數十萬人因此死亡。拜青蒿素聯合療法(artemisinin-combination therapy,ACT)所賜,近年來瘧疾疫情有大幅下降的趨勢;然而,東南亞某些國家已發現對青蒿素具抗藥性的瘧原蟲而導致治療失敗的案例,若該抗藥基因蔓延至非洲,預計將引起毀滅性的瘧疾反撲,如同 1970 年代鼎鼎大名的奎寧(Quinine),其藥效隨著大規模的使用而逐漸減弱。因應世界衛生組織(WHO)在西元 2040 年根除瘧疾的目標,研發新藥物或新療程是無非是現階段的首要任務。不幸的是,惡性瘧原蟲的基因體絕大多偏向 A-T 鹼基對(>80%),使科學家難以利用同源重組(homologous recombination)或 CRISPR 等標靶技術深入研究基因的功能,過去幾十年來僅成功建立數百個惡性瘧原蟲突變體。

為克服前述之技術性困難,研究團隊改為利用優先插入 TTAA 序列之 piggyBac 跳躍子,在惡性瘧原蟲基因體的編碼和非編碼區域中,平均每 70 個鹼基對就有一個插入位點,理論上可完成全基因體的定點飽和突變。為了擴大 piggyBac 突變的操作規模,研究團隊開發了一種高通量技術,可使基因體僅產生單個跳躍子插入點,並結合 Illumina 定序方法鑑定該位點,亦稱為 quantitative insertion-site sequencing (QIseq)。該團隊利用機器手臂執行高通量轉染突變技術(high-throughput transfection mutagenesis),將 piggyBac 跳躍子轉染至野生型惡性瘧原蟲基因體,建立約 38,000 個突變株,全數皆經 Illumina 定序確認含有不同 piggyBac 的插入位點。

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研究團隊利用突變指數得分(mutagenesis index scores, MISs)及突變適應度得分(mutagenesis fitness scores, MFSs)分析發現,所有 piggyBac 跳躍子的插入位點共影響 5,399 個蛋白質編碼基因,該團隊並接續執行一系列的分析,以了解編碼和非編碼序列插入的分佈、突變後造成的基因表現差異及蟲體在競爭環境中之存活潛能。在此過程中,研究團隊鑑定出 2,680 個惡性瘧原蟲感染血液階段期間,於體外生長所必須的基因,包含抗藥性相關基因:K13、mdr、dhfr-ts 及具新藥標靶潛能之基因:pkg 及 cdpk5;另估計約有 1000 個未知功能的保守基因(conserved genes)將可能成為未來藥物開發及抗藥研究的新標的。

近期有關青蒿素聯合療法的遺傳分析研究指出,惡性瘧原蟲泛素/蛋白酶體系統(ubiquitin/proteasome system)的細胞壓力反應機轉與其抗藥性有關,研究團隊利用 piggyBac 突變技術進一步發現涉及蛋白酶體降解的 72 個基因中,有 54 個被歸類為必須基因,故可優先針對該反應途徑設計藥物標靶。此外,該團隊亦發現蛋白酶體抑制劑 Bortezomib 可使青蒿素敏感的惡性瘧原蟲再提高 10 倍之敏感性。

本研究之通訊作者 John Adams 和 Rays Jiang 等表示,利用高通量飽和突變技術(high-throughput saturation mutagenesis)完整辨識惡性瘧原蟲生長的必須基因,將為瘧疾治療之路開啟新的扉頁,同時指出此策略亦為其他表型之系統性功能篩選開闢了新方法,如傳播和細胞黏附等。John Adams 進一步表示,利用他們所建立的基因分析工具,將可鑑定每個基因對於惡性瘧原蟲生存的相對重要性,幫助指引為來藥物發展的方向,並釐清青蒿素作用機制與蛋白酶體之間的關聯。

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文 / Angela Chang

參考文獻:
1. http://science.sciencemag.org/content/sci/360/6388/eaap7847.full.pdf
2. https://www.genomeweb.com/sequencing/human-malaria-parasite-mutagenesis-highlights-essential-genes-potential-drug-targets#.WvEahKSFOUk
3. https://www.nih.gov/news-events/news-releases/essential-malaria-parasite-genes-revealed

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