細胞治療的基礎研究、臨床應用及產業發展 ─「2018 細胞培養技術研討營」完整呈現

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「2018 細胞培養技術研討營」由食品工業發展研究所主辦,岑祥股份有限公司協辦,分別於 8 月 9 日在台北醫學大學與 8 月16 日在中國醫藥大學舉行,現場座無虛席,反應熱烈。細胞是基礎生醫研究的重點材料,可用以研究微觀細胞活動、功能、基因或分子機制等生理角色,是應用科學、臨床醫學以及藥物醫學的基礎。為引導更多新進生命科學領域的學子學習正確細胞學技術觀念與操作,而達到各實驗室知識管理之效,本研習營提供給臨床醫師、碩博士班研究生、研究人員關於細胞培養操作的演講,讓參加學員能夠對細胞學技術操作有正確的認識。

岑祥公司樓總經理分享研討會舉辦的心路歷程 :

細胞培養任我行:基本概念與相關設備介紹

首先,國衛院細胞庫計畫主持人、也是食工所研究員的許瓈文博士指出,血清雖然能保護細胞,但卻因含有不明成分,具有感染風險,因此在血清的選擇上,要看內毒素含量 (endotoxin)、細胞成長檢驗 (cell growth test)及生化檢驗分析指數,至於實驗室的特殊要求,則要看血清提供的公司有無辦法提供特殊服務;在設備的部分,生物安全櫃 (biosafety cabinet,BSC) 是基本的防護設備,分為 Class I、II、III,其中以 Class II 最常見;而在 BSC 的確效測試方面,因新增了抽風馬達,讓氣體不會吹向操作人員,除了可確保樣品不會洩漏,也能達到保護操作人員、維持無菌環境。細胞培養需使用二氧化碳培養箱,該設備可依實驗室需求與預算作選擇,例如:溫控、二氧化碳感應器、滅菌控制、水盤等。離心機常用 15ml/50ml 的離心管,接頭 (adapter) 要能夠穩定試管底部,若是感染性檢體可選擇密封的離心杯。關於細胞冷凍保存,許博士提醒切莫反覆冷凍解凍、且盡量不要熱處理,至於目前封口方式的冷凍管 (cryosealed of vials) 已取得專利,可提供給需要的公司做使用。

許瓈文 博士

去去,壞菌走:談細胞培養的微生物汙染管理

食工所研究員張育甄博士表示,細胞培養必須在非常乾淨的環境進行,因此微生物汙染管理相當重要,舉凡營養培養、細胞來源、人員操作、反應試劑和設備都有可能造成污染。判斷是否為細菌污染的方式有:觀察物質的運動性、形狀大小、數量是否顯著增加;培養基可用酚紅作為指示劑,若呈現紅色,則代表微生物代謝產生酸。最常見的污染來自黴漿菌 (mycoplasma),因其沒有細胞壁,無法以抗生素檢測,但該菌可能造成 DNA 斷裂、片斷化、基因表現異常、生長遲緩、代謝狀態改變等現象,唯獨細胞混濁度不一定會受影響。檢測黴漿菌的方法為在試管內培養三週使之增殖,再轉移到厭氧培養基兩週,該方法簡單且反應靈敏,但由於耗時長,可能造成部分菌種損失。此外,病毒汙染在實驗室並不常見,可透過觀察細胞病變作用(cytopathic effect, CPE),使用特殊抗體去結合病毒抗原,以免疫螢光染色法確認,或以聚合酶連鎖反應 (PCR) 放大核酸,但前提是必須了解病毒的種類才能決定偵測序列。另外,也可使用 酵素結合免疫吸附分析法 (ELISA)、免疫沉澱的方法,或直接使用電子顯微鏡觀察。為避免微生物汙染,需要有好的細胞來源,了解污染的源頭、汙染偵測的方式、好的操作、環境保存,並有策略性的使用抗生素和冷凍細胞,持續監控狀態,就能做好細胞培養。

張育甄 博士

輕鬆培養大量細胞?小而美的 3D 細胞培養術

大量細胞培養的方法相當多元,有細胞培養滾瓶 (roller bottle)、細胞工廠 (cell factory)、細胞方體 (cell cube)、細胞培養袋 (cell culture bag)、轉角瓶 (spinner flask)、生物反應器 (bioreactor) 等,此次美國 FiberCell System 公司的執行長 John J.S. Cadwell 博士,特別介紹結合中空纖維三維結構的生物反應器培養淋巴球細胞,搭配不含蛋白質的 Chemically Defined Medium High Density Serum (CDM-HD) 培養液、控制好 pH 值、細胞激素 (cytokine) 濃度等因素,可培養 109 到 1011 數量的細胞。此裝置可放入細胞培養箱,無需另外進行氣體、溫度控制,且電源線細小,可將整台設備放入生物安全櫃中操作。細胞培養環境不含界面活性劑、可減少細胞凋亡、減少 DNA 與蛋白質污染,並且經數個月的時間仍維持穩定。該技術可應用於製造 100mg 的單株抗體、100mg 的重組蛋白、胞外體 (exosome,又稱外泌體、外切體) 以及體外毒理測試等,較一般細胞培養方式更經濟實惠,也更節省空間。值得一提的是,它可應用於兩種細胞的共同培養,並且成功培養過血管內皮細胞與平滑肌細胞、腦血管內皮細胞與星狀細胞於體外形成血腦屏障。

執行長 John J.S. Cadwell 博士

金鋼狼的起源:多潛能幹細胞之發展歷程

食工所研究員盧懷恩博士以好萊塢電影 X 戰警的變種人金鋼狼作為開場,提到金鋼狼的再生能力就像幹細胞擁有自我更新、分化的功能,為疾病治療帶來新希望,也是科學家爭相研究的熱門議題。提到幹細胞的演進史,盧博士表示,自 1997 年科學家以細胞核移植方法將哺乳動物的成年體細胞培育成新個體,製造出桃莉羊,是世界第一個成功被複製的哺乳類動物,也掀起幹細胞研究熱潮;1998 年,美國科學家 James Thomson 教授首次從人類胚胎中取出幹細胞,被喻為「幹細胞研究之父」。然而,因倫理道德的爭議,使得幹細胞研究受到各種限制;2007 年,日本山中伸彌 (Shinya Yamanaka) 教授發現將纖維母細胞加入 Oct4、Sox2、cMyc、Klf4 四個基因能成功建立誘導性多能幹細胞 (induced pluripotent stem cell, iPSC),不僅克服免疫排斥且也沒有倫理道德的顧慮,因此於 2012 年獲頒諾貝爾獎,振奮幹細胞領域的科學家,也使得 iPSC 相關的研究與應用如火如荼地展開。iPSC 可分化成不同細胞,例如心肌細胞、腸道細胞、血球細胞,可用於建立疾病模型、藥物篩選,目前在日本的臨床治療上,從黃斑部病變移植手術、帕金森症、茲卡病毒引起的小腦症、再到心臟疾病等,未來可望推廣到更多疾病,嘉惠更多病人。

盧懷恩 博士

生技產業的開疆闢土:細胞治療之現況、挑戰與未來

食工所資深研究員兼副主任的黃效民博士則表示,當前細胞治療領域已成熟的技術有:全血或血小板血液移植、骨髓移植、主治第一型糖尿病的胰島細胞移植、軟骨/角質細胞移植等。其中,最具市場潛力的部分在於免疫細胞治療,例如近期備受矚目的嵌合抗原受體 T 細胞療法 (chimeric antigen receptor T-cell therapy, CAR-T),成功治癒白血病患者,也有不少新藥通過 FDA 核可,但藥價也十分高昂。在未來,幹細胞治療可望應用在神經疾病、心血管疾病以及罹病人數眾多的糖尿病等。由於細胞是活的、動態的,若運氣好則順利增生,幹細胞就會分化,但也存在可能長出不適合細胞的風險,再者,相較於藥品的純度須達 99%,細胞治療並無純度方面的要求,且細胞治療具有永久性的效果,修復、取代、再生可能同時發生不同形態和機轉,因此當前細胞治療遇到的挑戰是:製造過程的穩定性、細胞多樣性產生的有限貯架期、原料和方法的可行性等等。最後,黃博士提到,只有將產品商業化,才能真正創造價值,而近期政府推出細胞治療的特管辦法,在法規適度鬆綁下,期望促進生技業發展。

黃博士專訪影片 :

避免功虧一簣:不容忽視的細胞治療產品品管

北醫大校級細胞治療與再生醫學研究中心的吳友志博士指出,細胞治療是解決醫療照護的最後一塊拼圖,依細胞來源分為自體 (autologous) 與同種異體 (allogeneic),自體細胞意指細胞來源為自己本身,雖然成功率高但僅能提供捐贈者一人使用,而異體細胞指該細胞來源為他人,雖然有排斥問題但可為他人使用,因此備受關注。在台灣,細胞治療以往被歸類為醫療技術,由行政院衛生署的醫事處和藥檢局管理,特定醫療儀器施行或使用管理辦法修正草案提到,製程須符合人體細胞組織優良操作規範 (GTP),預防因使用人體細胞組織物而導入、傳播及擴散疾病,並確保人體組織物的效用與完整性。最近法規放寬,細胞治療被歸類為藥品,改由行政院衛福部食藥署 (TFDA) 和醫事司管理,在「特定醫療技術的再生醫療製劑管理條例草案」中提到,製程需符合 GTP 及 國際醫藥品稽查協約組織藥品優良製造指引 (PIC/S GMP),兩者都需要有製程與管控 (CMC) 數據,包括產品製造與特性資料、最終產品的放行測試、批次分析結果、產品的安定性;GTP 規範的目的是為了保護操作人員、防止疾病擴散、產品的製造和原料、製造與製程管控、確保細胞品質一致等,採實地訪查,再經由再生醫學諮議小組專家審查,最後送件至食藥署 (TFDA) 審核。

吳友志 博士