生物資訊與環境微生物 – 第三屆亞洲微生物體趨勢論壇 (Asia Microbiome Conference)

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多體學與生物資訊讓微生物研究更全面

香港中文大學黃憲達教授表示在定序技術越來越步的時代下,產生數據很容易,各國政府和生醫產業界都投入很多資源以產生醫學、微生物、疾病、生物標記、診斷治療等相關數據,然後再進行分析。

目前市面上有四大定序平台包含 Illumina、Thermofisher、Pacific Biosciences、Oxford Nanpore 等。Illumina 和 Thermofisher 皆為短讀取(short read, 最多600 bp)的次世代定序(NGS)技術,定序準確率高,高達 99.9%(定序品質 Q30,鹼基的品質值 Q 值和該鹼基定序錯誤概率P 的關係如下:Q=‐10 log10 P,因此 Q30 表示錯誤識別概率是0.1%,即錯誤率0.1%,或正確率99.9%)。但它們對於高度雜合的基因體、高度重複序列、高 GC 含量的區域、拷貝數變異(copy Number Variation, CNV)、大片段的缺失/重複序列等問題,都面臨相當大的困難。Pacific Biosciences 和 Oxford Nanpore 屬於不需要進行 PCR 放大且長讀取(long read, 10-20 Kp)的第三代或第四代定序技術,其準確率低於前二平台,達 90 %(定序品質 Q10)。

大多數微生物的 16S rRNA 有 9 個高度變異區域(high variable regions, HVRs),透過選擇其中高變區的序列,進行定序,然後分析作為分類與鑑定環境或生物體內微生物之種類與群落。因此,對微生物的生物資訊研究來說,長短讀取數據都很重要,如同豪傑使用長槍,君王使用短劍,若二者交叉使用,將可獲得長序列且準確度高的定序數據。

香港中文大學 黃憲達教授

臺北醫學大學吳育瑋助理教授表示,科學家預估人類約有 1012 種微生物,但目前由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)公布的微生物體數據約 有 18 多萬種,顯示人類對微生物僅略知皮毛。過去人類從培養微生物來觀察其基因體,而無法得知它們的生長條件,很難培養放大,甚至有些可能是共生菌。 因此,期望從總體基因體學分箱方式(genome-resolved metagenomics)來重建微生物基因體,進而分析人體內以及環境微生物物種及群落,更期望能找出致病微生物與宿主之間的關聯性以及多體學應用。

一般來說,利用微生物的 16s rRNA 進行定序,再跟資料庫比較,找出它們的基因體的方法,有雖然成本便宜、數據容易分析、量化流程早已標準化,但仍有設計特定引子、在擴增過程過中產生誤差、因未知基因,而錯過潛在細菌的限制。而總體基因體學定序能解決以上的定序問題,將微生物都定序出來,但拼湊過程複雜且成本較高。在過程中,可以使用 K-mers 分析方法評估微生物的基因體大小以及其重複與雜合狀況。K-mer 是指將一條長度為 m 的讀取數(reads),連續切割成 k 個鹼基的字符串,最後分成 m-k+1 個k-mers。此外,使用 BLAST 可能無法找出尋找未知的微生物基因體。

臺北醫學大學 吳育瑋助理教授

圖爾思微生物體研究中心郭育倫技術長指出,人類的生活方式、飲食習慣、用藥都會改變其微生物菌相,所以需要整合基因體學、代謝體學、多體學、大數據等方法來研究微生物體。目前常見微生物基因體定序包含16s rRNA 與全總基因體散彈槍(Whole metagenomics Shotgun)定序法,而後者又可細分拼圖(mapping)和組裝(assembly),但仍有其限制。因此,在總體基因體分析的基礎上,進一步使用 binning 方法。來自同一菌株(strain)的序列,其核酸組成是相似的,於是可以根據核酸組成訊息來進行 binning。例如,依照出現的頻率(abundance profile,又稱豐度)組合成具有相似豐度圖譜基因組合(co-abundance gene groups, CAG),他們再挑選出所含基因數目近似微生物的 CAG,定義為 metagenomic species(MGS),再將 MGS 中的基因片段進行重組、與已知的物種比對,藉此探討物種、基因體的關聯。更重要的是,由於許多 CAG 代表著細胞內的生化或分子機制,故藉由分析 CAG 與 MGS 的關聯性得以瞭解微生物的生活型態以及致病機轉。

此外,也能結合代謝體學來分析腸道菌的變化,找出代謝疾病與微生物基因豐度(MGR)的關係,例如觀察肥胖患者的腸道菌於手術前後的變化。最後,郭技術長表示人類微生物體是一個相當複雜的生態系統,需整合微生物的總體基因體學、總體轉錄體學、總體蛋白質體學、代謝體學等體學以及寄主的基因體學和基因表現,再加上多體學資訊交流、多體學關連性分析、整合模型、生物驗證以及活體內和活體外的臨床試驗,來幫助人類更進一步探索微生物體以及找出它們與疾病的關係。

圖爾思微生物體研究中心 郭育倫技術長

環境微生物體:水域、水產生物、珊瑚

中研院湯森林研究員表示,地球上仍有 99% 未知的微生物,除了人體腸道菌、皮膚微生物之外,環境微生物也扮演相當重要角色,環境微生物總體基因體學幫助人們理解環境微生物多樣性、微生物群落之間以及微生物與環境之間相互關係。J. Craig Venter 博士進行全球海洋取樣考察,希望能找出全球海洋微生物基因並且編目。他在馬尾藻海中,發現 1800 多種新的海洋微生物,以及其 120 多萬種科學界從未見過的基因,而在全球海域發現近 600 多萬種新的微生物基因。湯研究員分享,他於 2006 年開始其微生物總體基因體學研究,曾在西伯利亞、南極、歐洲等國家湖泊等水域研究微生物的多樣性與環境的關係,也採樣南海深海水進行微生物體總基因研究。他也透過巨觀病毒學(Metaviromes)和總體基因體學觀察研究台灣翡翠水庫的微生物群落和病毒於颱風過境前後的變化。此外,他也研究珊瑚礁的益生菌,以幫助珊瑚復育。最後建議,環境微生物總體基因體的研究需要謹慎地收集樣本、驗證確認,並且與各領域專家合作,包括環境科學、微生物、分子生物、生物資訊、生物化學、生態學、數學等。

中研院 湯森林 研究員

海洋大學呂明偉教授和其研究團隊以總體基因體分析水產生物的腸內菌叢。他們以石斑魚物種為研究模式,但神經壞死病毒(nerve necrosis virus)、虹彩病毒、白點症病毒、壺菌等可能使石斑魚生病,影響石斑魚的腸道菌相,進而免疫力及抗發炎能力降低,影響其存活率和成長效率。因此他們從飼料、水溫、天然萃取物中採樣分析各時期石斑魚的腸道菌相變化。由於欠缺石斑魚腸道菌等基因體標準資料,他們先建立健康魚類的微生物基準,包含石斑魚每個發育階段、飼料、水溫等養殖環境等。然後,他們才能比對生病魚群和健康魚群之間的差異,再透過餵食不同抗病毒或含有水產生物益生菌的飼料,來提升魚群的免疫力,達到抵抗疾病的目的,並且觀察腸道菌相的改變跟免疫力的關係。他們也將石斑魚研究模式轉移到白蝦研究上,觀察病毒與白蝦腸道菌的關係,並且開始建立健康蝦群資料庫,已進行後續分析。

海洋大學 呂明偉 教授

東海大學楊姍樺助理教授表示,在偌大海洋中,已知珊瑚礁有 845 種僅佔 0.1%,而有 1/4 的海洋生物以珊瑚礁維生,因此珊瑚成為育養海洋生命的關鍵角色。此外,它具觀光經濟效益,甚至成為特定藥物的來源。近年來,透過總體基因體學研究,使得人類越來越了解珊瑚。珊瑚蟲(Polyp)是珊瑚的基本生存單位,其一端有開口,周圍圍繞著一圈觸手,內部有著類似腸道的消化腔和生殖組織。居住在珊瑚蟲體內的共生藻會提供珊瑚 95% 的碳原能量。從珊瑚剖面圖中,可觀察到不同顏色的區塊,特別是綠色區域常存在靠近珊瑚骨骼位置。楊姍樺助理教授透過次世代定序(NGS)和總體基因體學技術分析珊瑚骨骼的不同顏色區塊中的內岩生微生物(microbial endoliths)族群組成。他們發現不同顏色分層的珊瑚骨骼微環境中,存在著不同微生物族群。在大海中普遍缺乏氮來源養分,但他們發現在綠層裡的綠硫菌除了光合作用和硫化作用之外,更具有固氮作用,使珊瑚獲取養分。此外,硫酸鹽還原菌也會提供養分給珊瑚。

東海大學 楊姍樺 助理教授

延伸閱讀:治病「黃金」的規範及益生菌開發的挑戰與契機 – 第三屆亞洲微生物體趨勢論壇 (Asia Microbiome Conference)

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