生物资讯与环境微生物 – 第三届亚洲微生物体趋势论坛 (Asia Microbiome Conference)

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多体学与生物资讯让微生物研究更全面

香港中文大学黄宪达教授表示在定序技术越来越步的时代下,产生数据很容易,各国政府和生医产业界都投入很多资源以产生医学、微生物、疾病、生物标记、诊断治疗等相关数据,然后再进行分析。

目前市面上有四大定序平台包含 Illumina、Thermofisher、Pacific Biosciences、Oxford Nanpore 等。Illumina 和 Thermofisher 皆为短读取(short read, 最多600 bp)的次世代定序(NGS)技术,定序准确率高,高达 99.9%(定序品质 Q30,碱基的品质值 Q 值和该碱基定序错误概率P 的关系如下:Q=‐10 log10 P,因此 Q30 表示错误识别概率是0.1%,即错误率0.1%,或正确率99.9%)。但它们对于高度杂合的基因体、高度重复序列、高 GC 含量的区域、拷贝数变异(copy Number Variation, CNV)、大片段的缺失/重复序列等问题,都面临相当大的困难。Pacific Biosciences 和 Oxford Nanpore 属于不需要进行 PCR 放大且长读取(long read, 10-20 Kp)的第三代或第四代定序技术,其准确率低于前二平台,达 90 %(定序品质 Q10)。

大多数微生物的 16S rRNA 有 9 个高度变异区域(high variable regions, HVRs),透过选择其中高变区的序列,进行定序,然后分析作为分类与鉴定环境或生物体内微生物之种类与群落。因此,对微生物的生物资讯研究来说,长短读取数据都很重要,如同豪杰使用长枪,君王使用短剑,若二者交叉使用,将可获得长序列且准确度高的定序数据。

香港中文大学 黄宪达教授

台北医学大学吴育玮助理教授表示,科学家预估人类约有 1012 种微生物,但目前由美国国家生物技术资讯中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)公布的微生物体数据约 有 18 多万种,显示人类对微生物仅略知皮毛。过去人类从培养微生物来观察其基因体,而无法得知它们的生长条件,很难培养放大,甚至有些可能是共生菌。 因此,期望从总体基因体学分箱方式(genome-resolved metagenomics)来重建微生物基因体,进而分析人体内以及环境微生物物种及群落,更期望能找出致病微生物与宿主之间的关联性以及多体学应用。

一般来说,利用微生物的 16s rRNA 进行定序,再跟数据库比较,找出它们的基因体的方法,有虽然成本便宜、数据容易分析、量化流程早已标准化,但仍有设计特定引子、在扩增过程过中产生误差、因未知基因,而错过潜在细菌的限制。而总体基因体学定序能解决以上的定序问题,将微生物都定序出来,但拼凑过程复杂且成本较高。在过程中,可以使用 K-mers 分析方法评估微生物的基因体大小以及其重复与杂合状况。K-mer 是指将一条长度为 m 的读取数(reads),连续切割成 k 个碱基的字符串,最后分成 m-k+1 个k-mers。此外,使用 BLAST 可能无法找出寻找未知的微生物基因体。

台北医学大学 吴育玮助理教授

图尔思微生物体研究中心郭育伦技术长指出,人类的生活方式、饮食习惯、用药都会改变其微生物菌相,所以需要整合基因体学、代谢体学、多体学、大数据等方法来研究微生物体。目前常见微生物基因体定序包含16s rRNA 与全总基因体散弹枪(Whole metagenomics Shotgun)定序法,而后者又可细分拼图(mapping)和组装(assembly),但仍有其限制。因此,在总体基因体分析的基础上,进一步使用 binning 方法。来自同一菌株(strain)的序列,其核酸组成是相似的,于是可以根据核酸组成讯息来进行 binning。例如,依照出现的频率(abundance profile,又称丰度)组合成具有相似丰度图谱基因组合(co-abundance gene groups, CAG),他们再挑选出所含基因子目近似微生物的 CAG,定义为 metagenomic species(MGS),再将 MGS 中的基因片段进行重组、与已知的物种比对,借此探讨物种、基因体的关联。更重要的是,由于许多 CAG 代表着细胞内的生化或分子机制,故借由分析 CAG 与 MGS 的关联性得以了解微生物的生活型态以及致病机转。

此外,也能结合代谢体学来分析肠道菌的变化,找出代谢疾病与微生物基因丰度(MGR)的关系,例如观察肥胖患者的肠道菌于手术前后的变化。最后,郭技术长表示人类微生物体是一个相当复杂的生态系统,需整合微生物的总体基因体学、总体转录体学、总体蛋白质体学、代谢体学等体学以及寄主的基因体学和基因表现,再加上多体学资讯交流、多体学关连性分析、整合模型、生物验证以及活体内和活体外的临床试验,来帮助人类更进一步探索微生物体以及找出它们与疾病的关系。

图尔思微生物体研究中心 郭育伦技术长

环境微生物体:水域、水产生物、珊瑚

中研院汤森林研究员表示,地球上仍有 99% 未知的微生物,除了人体肠道菌、皮肤微生物之外,环境微生物也扮演相当重要角色,环境微生物总体基因体学帮助人们理解环境微生物多样性、微生物群落之间以及微生物与环境之间相互关系。J. Craig Venter 博士进行全球海洋取样考察,希望能找出全球海洋微生物基因并且编目。他在马尾藻海中,发现 1800 多种新的海洋微生物,以及其 120 多万种科学界从未见过的基因,而在全球海域发现近 600 多万种新的微生物基因。汤研究员分享,他于 2006 年开始其微生物总体基因体学研究,曾在西伯利亚、南极、欧洲等国家湖泊等水域研究微生物的多样性与环境的关系,也采样南海深海水进行微生物体总基因研究。他也透过巨观病毒学(Metaviromes)和总体基因体学观察研究台湾翡翠水库的微生物群落和病毒于台风过境前后的变化。此外,他也研究珊瑚礁的益生菌,以帮助珊瑚复育。最后建议,环境微生物总体基因体的研究需要谨慎地收集样本、验证确认,并且与各领域专家合作,包括环境科学、微生物、分子生物、生物资讯、生物化学、生态学、数学等。

中研院 汤森林 研究员

海洋大学吕明伟教授和其研究团队以总体基因体分析水产生物的肠内菌丛。他们以石斑鱼物种为研究模式,但神经坏死病毒(nerve necrosis virus)、虹彩病毒、白点症病毒、壶菌等可能使石斑鱼生病,影响石斑鱼的肠道菌相,进而免疫力及抗发炎能力降低,影响其存活率和成长效率。因此他们从饲料、水温、天然萃取物中采样分析各时期石斑鱼的肠道菌相变化。由于欠缺石斑鱼肠道菌等基因体标准资料,他们先建立健康鱼类的微生物基准,包含石斑鱼每个发育阶段、饲料、水温等养殖环境等。然后,他们才能比对生病鱼群和健康鱼群之间的差异,再透过喂食不同抗病毒或含有水产生物益生菌的饲料,来提升鱼群的免疫力,达到抵抗疾病的目的,并且观察肠道菌相的改变跟免疫力的关系。他们也将石斑鱼研究模式转移到白虾研究上,观察病毒与白虾肠道菌的关系,并且开始建立健康虾群数据库,已进行后续分析。

海洋大学 吕明伟 教授

东海大学杨姗桦助理教授表示,在偌大海洋中,已知珊瑚礁有 845 种仅占 0.1%,而有 1/4 的海洋生物以珊瑚礁维生,因此珊瑚成为育养海洋生命的关键角色。此外,它具观光经济效益,甚至成为特定药物的来源。近年来,透过总体基因体学研究,使得人类越来越了解珊瑚。珊瑚虫(Polyp)是珊瑚的基本生存单位,其一端有开口,周围围绕着一圈触手,内部有着类似肠道的消化腔和生殖组织。居住在珊瑚虫体内的共生藻会提供珊瑚 95% 的碳原能量。从珊瑚剖面图中,可观察到不同颜色的区块,特别是绿色区域常存在靠近珊瑚骨骼位置。杨姗桦助理教授透过次世代定序(NGS)和总体基因体学技术分析珊瑚骨骼的不同颜色区块中的内岩生微生物(microbial endoliths)族群组成。他们发现不同颜色分层的珊瑚骨骼微环境中,存在着不同微生物族群。在大海中普遍缺乏氮来源养分,但他们发现在绿层里的绿硫菌除了光合作用和硫化作用之外,更具有固氮作用,使珊瑚获取养分。此外,硫酸盐还原菌也会提供养分给珊瑚。

东海大学 杨姗桦 助理教授

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