2020 Asia Microbiome Conference 三大焦点:研究和产业趋势、营养与益生菌、青年科学家交流

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随着基因体技术的进步,推动生医研究的发展,针对微生物相关基因体的研究也更显热络。因此,第四届亚洲微生物体趋势论坛(Asia Microbiome Conference)邀请众多亚洲专家、学者分享“微生物体的发展趋势”、“营养与益生菌”、“青年科学家研究交流”等专题主题。基因线上特别摘录重点如下:

一、微生物体研究和产业的发展趋势

以牙周病快筛检测牙菌斑菌群

国防医学院 刘正哲 副教授

国防医学院刘正哲副教授介绍了应用基因检测技术,自行开发的牙周病(Periodontal disease)快筛检测试纸

牙周病为一慢性需要长期治疗的疾病,对于健保支出是一项经济上的负担,且近年研究发现牙周病菌会经由不同的途径进入身体器官组织,造成各类疾病,例如在阿兹海默症患者的脑中可检测出牙周病菌的 DNA,以及心血管疾病的病患血管中发现牙周病菌斑等。近年来由于定序和分子检测技术越来越精准,牙菌斑菌群经定序分析后,发现有三种细菌为主要开始造成牙周病病程,其中又以 P. gingivalis 为主要致病菌。

传统牙科以培养或分子检测的方式检测 P. gingivalis,缺点是费用高、需时长以及操作繁琐等,因此刘老师研究团队开发了一种成本低且快速检测的方法,以侧流免疫分析(lateral flow immunoassay)作为技术平台,使用奈米金接核酸作为探针来检测目标菌 P. gingivalis,优点为取得牙菌斑后不需经培养,直接萃取核酸后检测 16S rRNA,进行初步快筛检测,之后依据结果在进入正式医疗程序,此技术目前经临床试验显示具有相当高的专一性与灵敏度,未来将持续收集各式临床牙周病病患样本,持续优化技术。刘教授认为检测技术的发展不应是单独使用,目前临床上一些检测也是互相重复确认结果,若未来 NGS 的检测成本更低,在临床诊断上可与其他检测方法一起搭配,朝向预防医学的目标迈进,做到既精准又具预防的功能。

以次世代和三代定序来分析抗生素抗药菌株

中正大学 黄耀廷 教授

中正大学黄耀廷教授表示,他们以宏观基因体定序分析抗生素抗药菌株(combating antibiotic)的研究,并比较次世代定序(Short-read)与三代定序(Long-read)的差异性与优缺点。总体来说,次世代定序的优点是成本低,相关应用分析软件支援多,且灵敏度较高,但也因此得到的片段较短且混乱,致使分析上较复杂,因而准确度较三代低。三代定序的优点为准确度高,灵敏度高,速度快,可得到较长完整的片段,可作为real time的诊断,缺点是成本高,支援分析的软件较少。另外在实际临床分析中也发现一些值得注意的现象,定序分析的结果虽然可以得知菌株种类,但无法得知是否具有抗药性,因为细菌会以水平基因转移(horizontal gene transfer)方式或是累积突变后演化成抗药性,使得分析难度提高,具突变性的抗药性细菌,只要有点突变发生就会造成高度抗药性现象产生。

史丹佛大学的团队的近期发表使用三代定序分析人类粪便样本,发现了很多新菌种,其中有些是无法经由体外培养,经定序分析后可排列得到完整漂亮的基因体图谱,甚至在不同时间点做定序,可看出整个基因体的动态变化,这跟黄教授在分析临床病患用药前后的定序结果类似,每个时间点的定序分析结果都不一样,并可看到跳跃子(Transposon)跳来跳去的现象,证明细菌的演化是非常快的。此外,医生给予病患不同抗生素会造成一定的突变发生,一些演化的理论指出,当一个菌具有抗药性,是因为有很多突变必须同时存在,菌株才能存活下来。

黄教授并指出使用 NCBI 数据库比对定序结果,得到的资料很杂乱,因此很多单位会自行整理数据库(DATABASE),例如美国 FDA 就有自己的数据库。另外使用统计和大数据深度学习的综合数据工程算法,也可提高抗药性基因的分析。

以宏观基因体次世代定序(mNGS)诊断感染

图尔思生技 郭育伦 技术长

图尔思生技郭育伦技术长分享关于宏观基因体次世代定序(metagenomic NGS, mNGS) 于近几年在临床应用于检测脑膜炎、败血症、中枢神经感染与肺炎感染的案例,由于这几个疾病在临床上目前很难早期检测出确切的感染病原体,通常都以广效抗生素治疗,未能针对病原体对症用药,因此常出现病患被延误治疗,造成病情很快恶化。使用 mNGS 定序分析,能够经由完整基因体分析,检测出确切病原体及是否具有抗药性,并可发现新病原体,及排除是否为感染性疾病,在临床上能减少病患病程,以及不必要的医疗资源使用。例如在结核杆菌的临床传统检测培养需4到6周,且失败率高,阳性率低,操作繁琐,而以 mNGS 定序技术检测病原体总基因组,两天内可知道结果,阳性率约30%-60%,且价格较细菌培养和 PCR 便宜。另一个全球首例是,病患反复发烧,做了多种检测都无法确认感染源,用广效性及其他许多抗生素都无效,之后病患昏迷癫痫进入 ICU 后,使用 mNGS 检测出是螺旋钩虫感染,改用正确用药后32天就痊愈出院。

mNGS 应用在精准诊断感染医疗上为一新利器,未来若能持续的提升检测速度和数据分析方法与准确率,将可应用在更多的临床检测项目。

全球微生物产业趋势

Pacific 8 Ventures 傅斯诚 合伙人/医师

近年来微生物体(Microbiome)相关技术在全球创投是热门题目,Pacific 8 Ventures 傅斯诚合伙人/医师分享了目前全球微生物体技术在产业发展趋势。

在最新的产业发展方面,美国一家公司的产品只要以一管血液,就能检测一千多种病菌,快速检测病人感染的主因。另一家美国公司则是提供消费者可以上网订购分析肠道微生物的产品,并根据检测结果给予健康方面的建议。

因应微生物体产业的发展,许多相关的组织也应运而生,例如位于美国的粪便移植数据库(FMT BANKs) 的非营利组织 OpenBiome,可提供转殖与捐增的数据库服务;有些公司甚至提供微生物改造工程的客制化服务,提供学术或产业单位改造特定的细菌或菌丛,可应用各种疾病的治疗。举例而言,透过改造益生菌,使其产生病患体内缺乏的酵素,让菌落在肠道内持续产生酵素补给,来治疗疾病。目前已有各种的 FMT 在临床试验,预计在未来几年就会有微生物治疗产品上市。此外,目前在免疫疗法中发现,有些病患体内存在某些菌株,对免疫疗法的反应较佳,因此许多大药厂纷纷投入大量资金研究开发,以期能找到适当的菌株,提升免疫疗法的成效。

由于发展快速,微生物体产业目前也面对许多的挑战,例如:在数据分析上过度简化问题、找到最接近人类的动物模式、许多作用的理论机制尚未完全清楚、专利策略问题、临床试验的设计、安全性考量、制造量产标准以及市场、投资人与消费者的适当观念建立等等。虽然面临许多挑战,但从 2009 年来全球在微生物体产业的投资资金依然持续的快速暴增,微生物体产业在全球投资界目前无疑是相当地炙手可热。

延伸阅读:第四届亚洲微生物体趋势论坛:对抗巴金森氏症和癌症等疾病?可从微生物下手?

二、营养与益生菌

多吃多长高? 营养共舞肠道益生菌之学童体位研究

台北医学大学 谢荣鸿 教授

台北医学大学谢荣鸿教授长年投入学童健康体位研究与相关辅导推广计画,指出近年我国学童平均身高逐年下降归因于均衡饮食的概念并未普及,他带领团队着手肠道菌与营养之于体位发展的研究。先前相关研究指出,在一般营养状态下肠道中的胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus Plantarum)会制造短链脂肪酸(short-chain fatty acid),诱发类胰岛素生长因子(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)而促进长骨生长。

研究团队进一步以对照组的营养不良小鼠实验,证实特定该菌种与其分泌的 IGF-1 对体位发展的高度关联性。此外,抗生素亦引起研究团队的重视,食物链中残留的抗生素改变肠道菌相而促进小鼠体位发展和成熟,后期生长却趋于迟缓且易于堆积脂肪;已有文献指出,使用低剂量抗生素治疗 (low-dose antibiotic treatment)于中低收入阶级营养不良的青春期前儿童可刺激早期发育。

谢教授呼吁大众应正视儿童营养问题,以红孩儿症(Kwashiorker)对照健康双胞胎的肠道菌实验做总结,指出重新建立极度恶性营养不良的孩童之肠道菌相具极限,因此日常均衡营养是不可或缺的。

精神益生菌 PS128 顾神经情绪率先从肠道下手

阳明大学 蔡英杰 教授

早先于 2015 年《Nature》以“Mental Health: Thinking from the gut”的标题刊登精神益生菌 (psychobiotics) 相关研究,指出肠道菌对于情绪及精神疾病易扮演着重要的角色。“肠道如同人体第二个大脑”,以胚胎学的角度来看,胚胎细胞首先发育为肠与脑并以神经系统串接,是为肠-脑轴 (gut-brain axis) 概念。

阳明大学蔡英杰教授从事细菌相关研究多年,认为肠道菌株可能直接影响大脑,该团队以小鼠模型证实益生菌 L. Plantarum(PS128)进入肠道后,可间接预防和改善大脑激素的分泌,例如调节前额叶皮质多巴胺(dopamine)浓度提升和可体醇(cortisol)浓度降低,有效改善小鼠的类忧郁、类焦虑、类妥瑞及类巴金森症状。PS128 是目前全球唯一经研究证实能够调节脑中多巴胺浓度的益生菌菌株。

研究团队进一步透过小鼠行为模式实验发现,帕金森氏症小鼠透过 PS 128 治疗后其运动迟缓(bradykinesia)与动作协调能力被显著改善,此外,PS 128 亦能改变与肥胖相关的肠道厚壁菌(Firmicutes)/ 拟杆菌(Bacteroidetes)的菌相比例。精神益生菌仍待更多研究厚植基础。

乳香姜黄柑橘打击慢性发炎 天然物成分改善肠道菌相

台湾大学 潘敏雄 教授

癌症化学预防(cancer chemoprevention)即以天然或合成之化合物预防、抑制、延缓或逆转癌症的形成与发展,是目前预防癌症与疾病形成的重要策略。台湾大学潘敏雄教授基于食品保健与疾病预防的角度,以细胞模式与动物模式评估乳香树脂、姜黄、柑橘果皮、姜、蓝莓、茶等饮食中天然物活性成分之抗发炎和癌症化学预防等生理活性与分子机制,希望借由饮食天然物的科学证据,提供疾病预防的新途径。

潘教授特别提到,柑橘果皮中多甲氧基类黄酮(Polymethoxyflavones, PMFs)成分能够抑制 BaP/ DSS 诱发的自嗜作用,达到抗肿瘤新生的效果,在小鼠模型中,PMF-A 和 PMF-B 能够调控 SREBP-1 和 Perilipin-1 蛋白质表现而降低脂肪细胞生长。

此外,天然物成分可能改变肠道菌相,例如,山竹粹取物 Garcinol 可改善 HFD 诱发 (High Fat Diet-Induced) 的肠道菌丛不良 (dysbiosis) 同时增加丁酸盐产生菌(Butyrate-producing bacteria, BPB)——隶属于厚壁菌门 (Firmicutes) 的瘤胃球菌 (ruminococcaceae) 和毛螺菌 (Lachnospiraceae) 制造短链脂肪酸丁酸盐 (butyrate),丁酸盐在调控基因表现上扮演了重要的角色,具有抗发炎跟调节免疫的功能。

胶囊包埋技术帮助益生菌通过胃酸到肠上皮细胞

葡萄王生技 陈劲初 总经理

葡萄王生技陈劲初总经理表示,发酵菌的培养、回收、干燥等一系列加工流程看似简易,其研究团队针对不同的机型设计适合的加热原理优化产率是关键。

另外,他们也进行研发胶囊包埋技术(Encapsulation)帮助益生菌,如 L. Acidphilus La-14、L. Plantarum GK4、Lc. Lactis、L. Plantarum GKM3、L.Brevis KB290 顺利通过胃酸和胆盐环境到达肠上皮细胞,致力于开发抗过敏、抗胃幽门杆菌、降低体脂肪、抗老化、提升记忆力等菌株。

延伸阅读:好菌留下、坏菌出去!第四届亚洲微生物体趋势论坛热烈展开

三、青年科学家研究交流

即时直接分析(DART)一分钟内搞定微生物次级代谢体分析

台湾大学 徐丞志 助理教授

台湾大学徐丞志助理教授提到,肠道菌对膳食纤维发酵会产生次级代谢体,包括短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs),如乙酸、丙酸、丁酸。许多研究指出, SCFAs 会对于人体造成各种不同的影响,与免疫调节、神经调节相关,于是分析短链脂肪酸是研究肠道菌相当重要的一环。传统上,以层析分离搭配质谱的方法尽管具高灵敏性,往往需耗费过高时间和人力成本,有失为高效率的分析方法。

该研究团队以即时直接分析(Direct Analysis in Real Time, DART)方法作为分析微生物次级代谢体的工具,其在常温常压下,载气经放电产生等离子体,而其中的激发态原子瞬间脱附并离子化样品中的化合物,进而以质谱或串联质谱检测,相关应用可见于美国团队研发的“质谱笔 (MasSpec Pen) ”于癌症检测,该技术提供了16 sRNA 基因测序以外的分析途径,其高效率显著见于分析时间从原来 10 分钟大幅降低为 0.5 分钟,能广泛应用于大鼠粪便研究、微生物基因改造萃取液,期望未来陆续推广至各实验室并运用在临床定量分析。

Dusp6 缺乏促棕色脂肪基因表现 提升燃烧脂肪和产热

成功大学 阮振维 助理教授

根据流行病学统计,已有许多科学证据指出肥胖和肠道菌群之间具关联性,甚至进而透过改变肠道菌落达到控制肥胖的目的,尽管如此,多数文献将焦点放在益生菌对代谢适应症的作用,而有关抗肥胖本身的资讯相当有限。成功大学阮振维助理教授透过标准化 Dusp6 基因缺失的小鼠模型 ,发现其对饮食诱发的肥胖具抗性,尽管该小鼠是健康个体,然而这在演化上是不合理的。

当我们进一步将镁光灯打在宿主身上,是否演化机制留下的特定菌种能够合理化这个现象?例如,冬眠前后或营养成分改变的状况下,熊的肠道菌都会随着环境被改变,这给了研究团队一个新的点子,或许 Dusp6 会迎合寒冷菌相,后续研究发现,Dusp 6 缺乏会促进棕色脂肪基因表现,提升燃烧脂肪和产热,RNA 定序亦证实这个想法,并有证据指出 Dusp 6 是微生物依存的产热开关,且对新生儿肠道菌相的发展扮演至关角色。该研究盼透过肠道菌群益生菌或粪便微生物群移植开发新的抗肥胖策略。

宏观基因体从零拼凑基因图谱 微生物研究化繁为简

台北医学大学 吴育玮 助理教授

对于我们所“已知”的细菌基因体,真的全数排除偏差值(bias) 解密了吗?分析微生物体基因资料的难度主要来自于各种细菌基因序列的混杂。在面对数千个疾病相关的细菌宏观基因组时,该如何在没有参考数据库的情况下重建基因体资料、甚至计算每个基因体的覆蓋性(coverage))和丰富度(abundance)呢?

台北医学大学吴育玮助理教授指出,这样的挑战就像要破解几百盒完全不同的拼图在全部拆解后重新拼凑出来的复杂度一般。为了解决这个问题,该研究团队开发出了分群算法“MaxBin”,运用机率分析与机器学习算法将微生物体基因序列进行分类,以简化后续的各种分析与处理,简而言之,从重新(de novo) 组装(assembling)和分箱(binning) 即是宏观基因体组装基因体( Metagenome-Assembled Genomes, MAG)演算模组二大精要环节。以拼图作比喻,就是将几百盒混在一起的拼图分类为几百堆,每堆只包含来自一种拼图的碎片,大幅降低后续的分析复杂度,并借由分群后的个别基因体促成我们对未知物种的认知。

吴助理教授进一步分享有趣的实验,一只相同细菌,利用“已知”细菌基因体比对 MAG 重建的基因体图谱,发现一致性有所差距,约 70-80% 的基因是相近的、20-30% 则不一致,这样的实验结果显示,我们对于“已知”的细菌基因体仍存有许多未知。最后,讲者玩味地点出面对资料分析时,没有一项工具能给完美的答案,尽可能排除黑盒子效应是我们当前能努力的方向。

以多体学分析共轭多炔次级代谢物

中研院农生中心 杨玉良 助研究员

中研院农生中心杨玉良助研究员提到,共轭多炔(conjugated polyynes)是不稳定的次级代谢物,主要存在某些植物、海洋生物、和真菌体内找到。然而,仅有少数被发现存在于细菌,透过基因体分析技术。

他们的究团队透过细菌多炔 BCGs 谱系分析, 发现只有 0.2% 的细菌种类,如 Massilia sp. YMA4 具有制造共轭多炔的潜力。由于共轭多炔的产量不稳定,该团队透过综合的多体学(Omics)的方法,包含 RNA 定序转录体及代谢体学等领域,在 Massilia sp. YMA4Candida 培养基探讨相关基因不活化与抗生素间的关联性。相关研究盼提高生物防治剂和治疗剂的效率,将原位代谢组学(如成像质谱)、比较代谢组学 (如分子网络)和基因组/转录组技术整合为微生物天然产物研究的综合策略。

杨助研究员最后指出,微生物固然重要,然而纵观自然界,微生物仅是偌大问题里面其中一个环节,具备多元的角度和广阔视野解决问题,并多方尝试与他人合作的能力更是重要。此外,更盼望国内学术界能凝聚力量,发展开放式平台助资源有限的研究环境创造更高的价值和可能性。

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学界和业界应积极参与及合作 推动台湾精准医疗和健康进展

亚洲微生物体趋势论坛提供台湾微生物学界和产业界一个讨论交流的平台,让台湾与亚洲的专家学者们齐聚一堂。综观本次论坛众多研究,肠道微生物相和其他微生物与寄主健康和疾病之间的关联性以及益生菌的开发已逐渐成为主流科学前沿。除了原本次世代定序和三代定序及宏观基因体学应用于微生物研究之外,多体学研究特别是培养体和代谢体学以及无菌鼠的角色也越来越重要。最后,台大医院吴明贤副院长提到,希望学界和业界积极参与及合作,促进微生物相的了解和加速实际的临床应用,推动台湾精准医疗和健康进展。

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