新冠肺炎(COVID-19)疫情蔓延全球,慢性病患者及老年人是高风险族群,然而不仅于此,各国传出部分青壮年患者染病过世,起因于患病后引起体内的细胞激素风暴(cytokine storm)进而导致死亡。什么是细胞激素风暴?对此,国家卫生研究院免疫医学研究中心谭泽华特聘研究员兼主任娓娓道出:“新型冠状病毒(SARS-CoV-2,新冠病毒)引起人体过度的发炎反应,活化免疫细胞并产生大量细胞激素,进一步造成器官的损伤及衰竭,严重时会导致休克进而死亡。”
面对病毒的挑战,目前世界各国皆未能提出真正有效的因应措施及疗法,疫苗和新药的开发都必须经过许多学理面的验证,以及需有严谨、系统化、科学化的证据支持。然而,目前除了透过人类检体和影像分析,观察新冠病毒攻击的细胞种类以外,体内的细胞激素变化,更需要人源化动物模型(humanized animal model)作为研究基础,才能获得更贴近真实的实验数据,在进行完整的动物实验之后,才能继续进行人体试验。
基因转殖和 CRISPR 基因编辑建立人源化 ACE2 病毒受体模型
目前科学界以基因转殖和 CRISPR 基因编辑二种基因工程方法来建立人源化动物模型。以人源化 ACE2 小鼠模型为例,基因转殖是将人类 ACE2 cDNA 转殖至小鼠内,建立人源化动物模型。事实上,将人类 ACE2 基因片段插入小鼠染色体中,是随机无法控制其位置,而造成该基因表现量的差异,因此建立符合实验需求的拟人化 ACE2 基因转殖小鼠模型深具挑战性。基因转殖小鼠模型依照不同的转录启动子(promoter)可分为组织特异性和全身性等 2 种,组织特异性基因转殖模型可因实验需求不同,其设计而有所调整。例如,想要观察新冠病毒入侵肺部机制,可建立肺部特异性的基因转殖小鼠;若要研究细胞激素风暴的话,可同时建立肺部特异性和免疫细胞特异性的转殖基因小鼠。而全身性基因转殖小鼠模型,是在每个组织都会表现 ACE2,另也可用小鼠原生性的 ACE2 启动子来启动人类 ACE2 表现,此模型能帮助科学家进一步观察新冠病毒如何影响多重器官。
CRISPR/Cas 基因编辑技术则是可将老鼠与人类不同的基因互相置换,包含 Indel 基因破坏、特定点突变、小片段 (< 4Kb) 基因敲入(knock-in)、大片段(4Kb-20Kb) 基因改造。因此,可置换人类 ACE2 基因至小鼠基因中,以创建人源化 ACE2 病毒受体小鼠模型。
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“相较于疫苗和药物的动物模型,以 ACE2 小鼠模型模拟人类细胞激素风暴更显得是一项难题。”谭主任说到。
以疫苗开发来看,动物模型主要进行安全性测试,并测试各类疫苗试验品,其诱导产生之抗体与细胞免疫反应,是否能保护小鼠对抗病毒感染。新药开发方面,则是用来测试不同药物抑制新冠病毒的效果和安全性,这二种拟人化 ACE2 小鼠模型开发门槛相对较低。
然而,免疫发炎反应太过激烈导致的细胞激素风暴,无法被即时关掉。加上许多免疫细胞参与其中,如 T 细胞、B 细胞、巨噬细胞等,并且释放出多种促发炎细胞激素,例如 IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-12 和 IL-17、TNF-α 等。甚至发炎调控转录因子 NF-κB 也被发现参与其中,如此错综复杂的体内免疫反应,使得建立该类型的小鼠模型成为一件困难的事。
至今,新冠肺炎之细胞激素风暴小鼠模型仍尚未建立成功。 因此需要免疫学和病毒学专家一起集思广益共同研究,拟定各种假说、建立适当动物模型,方可厘清细胞激素风暴的真面目。
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开发时程和资源受限
谭主任表示,基因转殖小鼠模型的建立需耗时 3 至 6 个月;CRISPR 基因编辑小鼠模型则因成功率不高而更加费时,一般而言,需 6 个月至 1 年才能建置完成。 另外,在疫情期间,实验需求大增,在P3设备、人力等资源有限情况下,若要获得合适的小鼠模型,仍需排队等候 6 个月至 1 年以上,因此不是每个实验室想做动物实验就可立即实行。这种僧多粥少的难题,与各国医疗院所医护人员、防护设备、呼吸器缺乏的状况相似。
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除了 ACE2 基因转殖小鼠模型之外,谭主任亦提到 ACE2 的辅助受体(co-receptor)也可能是未来动物模型的选择标的。现已有研究指出包含 TMPRSS2、CD147、AT1R、ADAM17 等辅助受体及类铎受体(toll-like receptor)可能皆与细胞激素风暴有关。因此,如果在单一基因转殖小鼠模型上,观察不到预期的效果,下一步则该考虑使用双重(Double)或三重(Triple)基因转殖小鼠来试验,例如 ACE2 合并 TMPRSS2 或者 ACE2 合并 TMPRSS2 加上 CD147 基因转殖小鼠来检测 。
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最后,谭主任表示,基因转殖小鼠的实验数据,仍需以谨慎的角度来看待,即使在动物模型中能够模拟细胞激素风暴,但未来在人体试验也未必能获得相同的结果,这点是所有研究人员须要特别留意的地方。另外,无论是动物模型、人类检体或人体试验,任何实验当中的小突破或失败数据都别具意义,留意数据中的细节将能节省资源和时间的消耗。因此,应当汇整多领域的研究结果相辅相成,共同努力一起解决细胞激素风暴的难题,以期对抗新冠肺炎疫情。
采访:Thomas Huang, Parker Yang
撰稿:Parker Yang
审稿:Alma Wu
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