预测下一个生技世代的风貌(三): 蛋白质体学的即时掌握

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随着基因体学、蛋白质体学、和 CRISPR 技术逐渐成熟,运用三种技术群的整合性方案陆续推出;而在台湾,图尔思生物科技也正致力建立次世代定序、蛋白质萃取和分析、以及 CRISPR 相关组件的整合式服务。未来在研究和临床治疗上,也许就有一套标准化模式,先从基因体找出可能的问题点,再利用蛋白质体工具检验生理层面上的障碍,最后透过 CRISPR 等工具修饰基因,从本质上排除问题。这样的未来,实现的速度或许会超越大家的想像!

尽管人类基因体已在 21 世纪初期完成定序图谱,但是后来基因学家和生物研究人员逐渐发现基因体序列好比一张蓝图,仅能知道有什么基因可能会表现,可是无法得知哪些基因被表现、在什么时机表现、以及基因表现后的蛋白质修饰情形等等。这样的氛围带动了蛋白质体学的兴起。所谓蛋白质体,就是一个生物个体在特定时间当下所表现的所有蛋白质,而蛋白质体学则会利用各种工具探讨这些蛋白质的种类、数量、分布、以及修饰情形 (如:裁切状况、增添糖基、双硫键结等)。目前蛋白质体学已可针对健康和发病组织表现的蛋白质体进行分析和比较,对于未来研究疾病起源、及早诊断病症、以及实现个人化治疗将会有相当大的帮助。

认识蛋白质体学 (proteomics)

“蛋白质体 (proteome)”一字于 1994 年由澳洲遗传学家 Marc Wilkins 在攻读博士期间率先提出,是希望为人类蛋白质建立有如基因体 (genome) 定序一般的完整认知。Wilkins 教授后来也发展多项蛋白质分析工具,这些工具也成为蛋白质体学门户网站 ExPASy (https://www.expasy.org/) 的主要骨干。至 1997 年,“蛋白质体学 (proteomics)”的概念正式问世,也象征生物学家开始直接检测和分析生物体内的各种蛋白质成分和状态,而不再从基因 (genomics) 或转录之讯息 RNA (transcriptomics) 的角度去推敲各种蛋白质是否真的有表现。不过蛋白质体的分析难度确实相当高,截至 2014 年 5 月才有德国和美国的团队分别在 Nature 期刊发表人类的蛋白质体图谱;但美国的图谱涵盖 17,294 种蛋白质 (估计占人类蛋白体的 84%),德国的图谱则包含 18,097 种蛋白质 (估计为人类蛋白体的 92%),也就是说仍有将近一成的人类蛋白质还没被发现,图谱尚未完整,同志仍须努力!更有趣的是,这两份图谱共计有 193 个蛋白质是由“非基因”的 DNA 所表现,意味目前对基因的定义和认识并不完整,而未来加以阐明蛋白质体后,或许人类基因定序图谱也必须随之重新检视和修正。

蛋白质体学的主要研究工具

蛋白质体学的研究主力目前为质谱仪 (mass spectrometry, MS) 和微阵列 (microarray),这方面的主要仪器和试剂厂商包含美国的 Sigma-Aldrich、ThermoFisher Scientific、Bio-Rad、Agilent、 Affymetrix 等等。不过目前各路厂商的市占率均未超过 15%,甚至排名前十的厂商之市占率也未过半,表示蛋白质体学仍是胜负未定、值得逐鹿的蓝海领域。台湾的图尔思生技在近年也看准这样的情势,选择于国内推出完整的蛋白质萃取、分离、标记、侦测、分析、和确认技术,可应用在蛋白质片段的质量测定、定量分析、交互作用 / 位置分析、以及追踪蛋白质表现的变化趋势等等。现在,就让我们来深入探讨蛋白质体学的应用,并介绍最新技术和研究趋势:

(1) DISCOVER:发现新的蛋白质
若希望从茫茫的组织和细胞中发掘全新的蛋白质,质谱仪 (MS) 堪称是最佳利器。MS 会透过强大电流、分子碰撞、或其他物理 / 化学方法将样品离子化,并让这些离子片段带有正电或负电。接下来,这些带电离子片段会被送入强大磁场打向质量分析器,而由于各个片段所带的电荷相对于片段质量的比例 (荷质比, m/z) 会有所不同,因此各离子片段受到磁力的影响也会不同。如此一来,各个离子片段就会在磁场内循独特的轨迹打到质量分析器上并产生电流,而透过这些电流的分析,质谱仪便可得知片段的质量,分子结构、片段数量、和样品纯度等参数,并可进一步和蛋白数据库比对分析出感兴趣的蛋白。当然,比对之后如果确定手上的样本在数据库完全没有出现,MS亦可提供蛋白质化学和结构的相关资讯,协助研究人员一步步揭开新颖蛋白质的面纱。

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延伸阅读:预测下一个生技世代的风貌(二): CRISPR 的积极进取

(2) DETECT:侦测目标蛋白质
质谱仪可精确辨识蛋白质的组成胺基酸,很适合用于发掘新蛋白质或解开未知蛋白质之间的交互作用。不过慢工出细活的道理自古不变,而质谱仪相对费心的前置作业和分析过程在分秒必争的临床和实务环境略有不足。蛋白质微阵列由数千种印在玻璃或特殊材质上的蛋白质所组成,能快速对特定样品进行筛检并得到结果。因此微阵列除可在第一时间侦测到血中病原而给急性感染者最准确的治疗,更有潜力对各类癌细胞侦测标记蛋白和突变蛋白,让癌症的诊断和治疗更有效率。近期也出现了雷射微解剖-反向蛋白质微阵列的最新技术,利用雷射将显微镜上的组织样本或生物切片进行解剖和切割,再置于微阵列载体上直接分解并萃出蛋白质以进行定性和定量分析。此方法相较于质谱仪更能迅速分析多种组织的蛋白质表现差异,因此除了可提供研究或诊断能参考的有效资讯,也可广泛运用在发生学和动物发育的研究,从微观角度探索发育过程中许多难解的秘辛。当然,微阵列也有其限制,像是蛋白质点印技术困难、价格偏贵、以及蛋白质体知识上的不足,但这些障碍应可随生物技术的进展而获得解决。不过蛋白质微阵列最根本的限制在于创新:也许微阵列可发掘蛋白质之间的重要交互作用,但是微阵列无法像质谱仪一样发掘前所未知的蛋白质。即使透过微阵列发现会和已知蛋白质有交互作用的未知蛋白质,最后也得透过质谱仪方能验明其身分。

(3) DIFFERENTIATE:大量辨识特定蛋白质
不过近年来,质谱仪也出现许多大量筛检蛋白质的工具,例如最新的 iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) 技术,是利用稳定的同位素结合在蛋白质的 N 端和胺基侧链,可同时将样本中的各种蛋白质进行相对和绝对定量。iTRAQ 技术会先将欲分析的蛋白质样本经过trypsin (一种蛋白酶,可将蛋白质切成小片段) 处理,再加入 iTRAQ 进行标记,接着进行液相层析串联质谱仪 (LC-MS/MS) 分析。透过四种质量相同但报告基团 (reporter group) 不同的 iTRAQ 标签,除了可依荷质比 (m/z) 直接比对数据库而定出蛋白质片段,更能依各报告基团讯号的强弱进行相对或绝对定量。由于 iTRAQ 技术有灵敏度高、分析范围广、结果可靠、重复性高等特质,再加上能同时针对四个样本定量数千种蛋白质的变化,故可有效应用于生物标记 (biomarker) 的开发,像是比较患者和正常人之间的蛋白质体表现差异而从中找出指标性的蛋白。如果想要了解药物处理前的蛋白质体变化或是磷酸化蛋白体的变化,也可以用 iTRAQ 同时观察数个样本间数千种蛋白质的变化找出有兴趣的目标,堪称是蛋白质体学的一大利器。

(4) DEVELOP:开发全新蛋白质体学应用
蛋白质在体内合成后往往会进行各种修饰,例如糖基化、磷酸化、水解、形成双硫键等等。质谱仪可精准地侦测和比较蛋白质的修饰状态,目前甚至可以追踪各种蛋白质糖基的形成过程,让研究人员对蛋白质修饰和功能之间的关系得以更深入探讨。

目前亟需这方面技术的研究领域就是代谢体学 (metabolomics),主要着重在了解代谢过程中产生的这些小分子代谢物的性质,并由此取得宏观资讯阐明生化反应途径、代谢网络及其交互作用、以及细胞、器官、乃至于个体的健康状态。举例来说,透过健康细胞和癌细胞代谢体的比较,研究人员即可发掘其中的代谢和讯息传导差异,更可从中开发生物标记,用以诊断疾病或追踪病程进展。另外,研究人员也可从健康和生病细胞 (或器官、个体) 的代谢体比较,找出致病机转、改善途径、以及药物标的等丰富资讯,对于未来精准医疗和个人化治疗有很大的发展潜力。随着新世代定序技术和蛋白质体学技术的发展,代谢体的研究也逐渐朝基因表现和蛋白质修饰的方向发展,因为除了小分子代谢物之外,细胞、器官、或个体在特定时刻或接受某种刺激后当下的基因表现和蛋白质修饰情形,对了解生理运作和反应也非常重要。在这方面,质谱仪亦可发挥很大的功能,除了用以分析传统代谢体学所探讨的小分子代谢物之外,更能发掘新蛋白质、监控蛋白质的表现和修饰情形、并追踪蛋白质之间的交互作用,有助于研究人员快速取得突破性的成果。

名词解释:代谢体 (metabolome) 泛指在特定时间下,一个胞器、一颗细胞、一种组织、一个器官、乃至一个生物个体所含有的所有小分子化合物。

蛋白质体学的医疗价值

2016 年 06 月 29 日,CPTAC 卵巢癌跨国研究团队在著名的 Cell 期刊发表以蛋白质体学整合性技术分析卵巢癌细胞的研究结果。研究人员针对 174 个高度恶性肿瘤的基因体和蛋白质体分析结果进行比较,对于癌细胞的突变基因子目对蛋白质体的影响、最会促进基因突变的蛋白质、以及最能影响患者存活率的蛋白质均有重大发现和突破。在近未来,当更多类似研究运用在更多细胞和疾病上之后,相信蛋白质体学会成为临床上不可或缺的诊断工具,不仅有助于即时掌握病情和治疗效果,甚至可及早预测未来可能发生的问题并加以预防,让人类对于自身健康也能拥有即时掌握能力。而在当今讲求分享的年代,已有许多蛋白质体学工具和数据库免费开放供研究人员使用,包括行之有年的瑞士 ExPASy 生物资讯入口网站:蛋白质专区 (http://www.expasy.org/tools/)、美国的西雅图蛋白体中心 (http://tools.proteomecenter.org/software.php)、和专攻质谱仪工具的 ms-utils.org 网站 (http://www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/SoftwareList) 等等,资源非常丰富,只要有样本和数据就不需烦恼后端分析。

基因体学、蛋白质体学、和 CRISPR 的整合应用实例

长庚大学的谭贤明教授在 2015 年透过基因体学、蛋白质体学、和 CRISPR 的整合研究,获得 2015 年中央研究院年轻学者研究著作奖。谭教授发现发育过程不可或缺的 ADAR1 脱氨基酶会受到微 RNA (microRNA) miRNA-1/206 的负向调控,进而使 ADAR1 的表现量随发育阶段而有所改变。谭教授更发现 ADAR1 可修饰并抑制肌肉发育的相关基因所转录出之讯息 RNA (mRNA),而当 ADAR1 在发育后期受到 miRNA-1/206 抑制后,这些肌肉发育相关基因的 mRNA 才得以移出核仁并转译出对应的蛋白质,以启动肌肉细胞的分化。最近谭教授更利用次世代高通量定序谱出汉人转录体的 ADAR 脱氨基酶修饰位点,并将 RNA 的修饰与基因表现、蛋白质作用、以及 miRNA 功能进行结合,其阐明基因到蛋白质的各种调控机制和修饰作用之研究成果令人期待!

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影片分享:
在生物技术蓬勃发展的今日,举凡 NGS、CRISPR 等技术进展迅速,使得基因体学、蛋白质体学也渐受重视,以下两个影片分别为长庚生医所的谭贤明教授,以及锋华生物科技的陈志德教授,分享生物技术领域的最新研究与应用:

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