单细胞定序不需进行全基因组增幅

‘加拿大英属哥伦比亚大学（University of British Columbia）的团队意识到单细胞定序技术的限制，致力于革新定序流程，研发出直接样本库制备法（direct library preparation，DLP），省略全基因组增幅的步骤，排除增幅过程所造成的技术与人为偏误，而且比以往使用的方式更精准可信。’

单细胞定序真实反映细胞的独特性

单细胞定序（single-cell sequencing）技术在 2013 年时，被《Nature Methods》期刊选为年度技术，这项技术突破了基因定序的应用，过去通常使用组织样本或细胞群进行 DNA 与 RNA 序列分析，透过分析运算样本细胞群取得平均值，但是这样的方式往往无法看到细胞个体的特性。

为了真实反映每个细胞的独特性，科学家分离出单一细胞，从中萃取遗传物质，再以全基因组增幅（whole-genome amplification，WGA）技术制造足量遗传物质以进行分析，单细胞基因体（single-cell genomics）被解码之后，更揭示了细胞个体的异质性（heterogeneity），应用于癌细胞的研究，可以更精确的了解单一癌细胞的基因体以及结构变化，更能侦测罕见的细胞变异，这项技术在其他领域如：微生物学、免疫学、神经生物学、胚胎发育学、组织嵌合（tissue mosaicism）以及产前诊断都有长足贡献。

精益求精现行技术仍有限制

尽管单细胞定序的应用令人振奋，但仍有许多技术上的限制有待改良，其中以 WGA 为例，这是造成偏误的主要步骤之一，因为要符合现有的定序技术，科学家必须将单一细胞基因体复制放大，以产生足够的遗传物质制备分析样本库（library preparation），常见的 WGA 技术有：DOP-PCR（degenerate oligonucleotide-primed PCR）、MDA（multiple displacement amplification）以及 MALBAC（multiple annealing and looping based amplification Cycles），各种增幅技术都有适用的情况，但不论何种方式都很难避免技术偏差，对偶基因若有异型合子的突变（heterozygous mutation），该基因无法透过聚合反应增幅而造成对偶基因丢失（allelic dropout，ADO），变异基因的伪阴性或伪阳性，聚合酶链锁反应所使用的引子（primer）品质会影响增幅基因组的覆蓋率（coverage），覆蓋率不足、不一致的覆蓋率等偏误（图一）都使单细胞的基因序列无法被真实呈现。

图一单细胞序列分析常见的偏误（a）对偶基因丢失、伪阳性或是伪阴性而造成覆蓋率不，其中 Pop 指细胞群体（a population of cell）（b）覆蓋率的度量包含覆蓋深度（coverage depth）以及总物理覆蓋率（total physical coverage），也就是覆蓋广度（coverage breadth）（c）覆蓋一致性（coverage uniformity）随着不同细胞而有差异。

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UBC 团队的新技术不需全基因组增幅

加拿大英属哥伦比亚大学的团队意识到 WGA 技术的限制，致力于革新单细胞定序的程序，在今年一月正式于《Nature Methods》发表新的研究成果，使用直接样本库制备法（direct library preparation，DLP），省略了 WGA 的步骤，不进行前置增幅（preamplification），排除基因增幅过程中所产生的技术与人为偏误，而且比以往使用的方式更精准可信。

科学家设计了一组 192 孔的微流体装置（图二），这套系统使用奈生（nanoliter）作为单为容积，可以直接针对单一细胞进行样本库制备，除了利用极微量的容积提高分析的分辨率之外，可充气的微流体分析盘能够随着不同的实验需求而变化容积大小，同时还有内建的标记引子（incorporated index primers），可以直接标记单一细胞，此外独立的影像系统让研究人员能清楚的观察细胞样本。

图二 192 孔微流体装置示意图

技术前景无可限量

高分辨率的分析设备搭配改良的运算流程，研究团队分析癌细胞株，将个别单细胞定序结果以电脑模拟汇合，模拟大量基因体分析的结果，得出相当一致的覆蓋率，同时更精确的侦测癌细胞的基因复制数改变（copy-number alterations，CNAs），大幅提升单细胞异质性的侦测，相较于现行的技术，新技术的花费与旧法相当，但是科学家有机会从中获得更多资讯，让单细胞定序的应用更有价值。

研究的主持人 Carl Hansen 博士表示，已将新技术的专利注册并为 AbCellera 所有，AbCellera 是 Hansen 博士所领导的生技公司，主要致力单株抗体疗法（monoclonal antibody therapeutics），虽然 DLP 技术与 AbCellera 的发展关联性较低，Hansen 也因此规划成立新公司发展商品化 DLP，不过 Hansen 相信未来可以将技术延伸应用于免疫疗法，使更多人受惠于革新的技术。

文 / Joanne Shih

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参考文献：
1.”Method Of The Year 2013″. Nature Methods 11.1 (2013): 1-1
2.Zahn, Hans et al. “Scalable Whole-Genome Single-Cell Library Preparation Without Preamplification”. Nature Methods 14.2 (2017): 167-173
3.Gawad, Charles, Winston Koh, and Stephen R. Quake. “Single-Cell Genome Sequencing: Current State Of The Science”. Nature Reviews Genetics 17.3 (2016): 175-188
4.Molika Ashford. “UBC group debuts single-cell sequencing method without whole genome amplification”. Genomeweb (2017)
5.Navin, Nicholas E. “Cancer Genomics: One Cell At A Time”. Genome Biology 15.8 (2014)

图片来源：
1.http://en.novogene.com/wp-content/uploads/2015/10/single-cell-RNA.png
2.Gawad, Charles, Winston Koh, and Stephen R. Quake. “Single-Cell Genome Sequencing: Current State Of The Science”. Nature Reviews Genetics 17.3 (2016): 175-188
3.Zahn, Hans et al. “Scalable Whole-Genome Single-Cell Library Preparation Without Preamplification”. Nature Methods 14.2 (2017): 167-173

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