检测肿瘤端粒长度更快速？新颖数位即时 PCR 诞生！

端粒是每个染色体末端的重复核苷酸序列区域，可保护末端免于降解，并且能调节染色体完整性。人类端粒由短串联重复序列（5′-TTAGGG-3’）组成，其在出生时的长度为 8kb ~ 15kb，并且在每个复制周期后缩小 50 ~ 200 个核苷酸。在一定数量的细胞分裂后，端粒达到临界长度，并且触发不可逆的细胞周期停滞，称为细胞老化。

越来越多研究证实，端粒（telomere）长度异常与糖尿病、心血管疾病等老化相关疾病以及癌症预后有关，但临床上缺乏简单、快速和可扩展的端粒检测和分析技术，使其临床应用仍有许多限制和挑战。例如，依赖于南方点墨法（Southern blotting）的终端限制性片段（terminal restriction-fragment, TRF）分析比较麻烦，并且不适合临床应用。此外，即时 qPCR 分析只能提供端粒长度的相对测量值，而定量萤光原位杂交（quantitative fluorescence in situ hybridization）只能评估处于分裂中期的活跃分裂细胞。肽核酸杂交方法 PHAST 需要专用设备，而且 STELA 方法还依赖于 Southern 杂交，而且很费时。

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近日，新加坡国立大学 Lih Feng Cheow 博士的研究团队开发出一种新颖的高通量数位即时 PCR 检测方法（high-throughput digital real-time PCR）——单一端粒绝对长度快速分析（single telomere absolute-length rapid, STAR），可以快速测量端粒的绝对长度（0.2 kb – 320 kb）和数量。相关研究结果刊登于《Science Advances》。

该研究团队指出，STAR 结合数位微流体设备、单细胞分析、数位 PCR 等技术来分析样本，以便在奈米公升隔室中测量端粒重复序列的数量。PCR 扩增使得 PCR 产物的增加，同时端粒重复片段的初始长度或拷贝数也成比例增加。其中，PCR 产物的增加反应在 DNA 结合染料的萤光强度变化中，例如即时监测萤光讯号所捕获的。此外，为了使检测方法提供绝对长度而不是相对长度，他们使用了不同数量的已知长度的合成端粒，以生成标准曲线，可根据该标准曲线计算其他端粒长度。

为了评估 STAR 检测端粒长度的可靠性，他们分别使用 STAR、TRF、即时 qPCR 来分析和比较 8 种癌细胞株（293T、HeLa、A549、K562、U-2 OS、WI38-VA13、NCI-H1299、Saos-2）的端粒长度。结果显示，STAR 与 TRF 测出来的平均端粒长度之间呈现高度正相关（R 2= 0.96）。STAR 与 qPCR之间呈现中度正相关（R 2= 0.78），主要是 qPC R依赖于单拷贝基因的标准化，因此可能会由于非整倍性，而导致在许多癌症中有显著偏差。由上述结果得知，STAR 是绝对端粒长度的可靠指标。更重要的一点是，STAR分析时间比 TRF 少 3 个小时。

再来，他们也使用 STAR 分析癌细胞的染色体外重复序列（extrachromosomal telomere repeats, ECTRs）。ECTRs 能使用同源重组的机制来保存其端粒，其数量可望反应癌细胞中端粒交替变长（alternative lengthening of telomeres, ALT）的状态，这与患者的预后较差有关，并且可作为临床医师治疗选择的参考。

另外，目前 ALT 检测方法包含 APB 检测和 C 圈分析，但这对于 ALT 活性不是完全确定的，可能会低估肿瘤中 ALT 的发生率。因此，该研究团队预估，整合多项 ALT 特征检测的 STAR 或许是能确定 ALT 状态且更灵敏的检测方法。所以，他们使用 STAR 来分析 4 个小儿神经母细胞瘤样本的 ALT 状态，发现 2 个样本带有 MYCN 扩增，其余 2 个具有 ATRX 突变。其结果与先前以检测方法得出的研究结果一致，这显示 STAR 可望成为新颖的肿瘤端粒维持的检测平台。

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参考资料：
Science Advances; 21 Aug 2020:Vol.6, no.34, eabb7944. DOI:10.1126/sciadv.abb7944