在实验室使用体外培养细胞株进行各种生物医药实验是最基础也最普遍的研究方法。但研究者手上的那个细胞株究竟从哪儿来?是否和最原始的细胞来源和其他文献记载的细胞相同呢?如果不同的话,那过去的这些研究……
真假神经胶质瘤细胞株 U87MG
这个故事从北欧最古老的瑞典 Uppsala 大学开始。U-87MG 神经胶质瘤细胞株,最早是在 1966 年由 Uppsala 大学从一位 44 岁多形性胶质母细胞瘤女性患者所分离出来,并成为研究脑瘤最热门的材料之一。从 PubMed (美国国家医学图书馆的生物医学相关文献摘要索引) 搜寻 U-87MG 细胞株可得到 1,700 多笔文献,总共约有 65,000 次引用!不过开发 U-87MG 细胞株的研究人员:Uppsala 大学肿瘤生物学教授 Bengt Westermark,当初在 1970 年代担任研究生时就认为 U-87MG 细胞株是他手上八种脑部肿瘤细胞株中生长最慢的,当时其实最不看好,后来也无法理解为何该细胞株如此受到青睐?但在 2016 年, Westermark 教授从美国典型菌种保存中心 (ATCC) 他当年开发的 U-87MG 细胞,却发现买进来的这些细胞与他学生时代记忆中的表现完全不同;因此 Westermark 教授决定进行一次完整的比较,从三个层次来验明 U-87MG 正身 (注 1)。
是否来自同一人?短纵列重复序列 (STR) 标记
Westermark 教授与其研究团队首先使用含有 16 组 STR 标记的套组工具进行分析。STR 标记可用来比对 DNA 是否来自特定个人,而且一次比对愈多组 STR 标记便能得到愈精准的结果。同时比对 16 组标记后所得到的结果,仅有 20 万兆分之一的误差率。Westermark 教授发现 Uppsala 大学保存的 U-87MG 细胞之 STR 标记和 ATCC 的细胞株不吻合,证实市面上流通的 U-87MG 细胞与当初建立的细胞株来自不同人。
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Westermark 教授面对这样的重大发现不敢轻忽,继续进行第二关的粒线体 DNA 定序。每个人的粒线体绝大部分来自母亲,而且在单颗细胞最多可存在上千套粒线体 DNA,因此检测所需的细胞数远小于 STR 标记。研究团队取出睽违 40 多年,经福马林防腐并包埋在石蜡的原始肿瘤组织进行粒线体 DNA 分析,同时和原始 U-87MG 细胞株与 ATCC 贩售的 U-87MG 比对,结果再度证实原始 U-87MG 细胞株与原始肿瘤组织相符,但来自 ATCC 的 U-87MG 则确定与原始肿瘤组织不同。
到底源自何种器官与组织?转录体分析
既然 ATCC 贩售的 U-87MG 细胞与原始肿瘤组织不同,那是不是意味使用这些细胞的 1,700 多篇文献以及其结论都不可信? 这可是会撼动 40 多年来的脑瘤和神经科学研究基础,因此 Westermark 教授不敢大意,遂进行第三关检查:转录体分析。研究团队将 ATCC 贩售的 U-87MG 细胞与麻省理工学院 — 哈佛大学布洛德研究所 (Broad Institute) 癌细胞株百科全书 (Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE) 中的十八个不同组织和 1,036 种细胞株的转录体比对后,发现 ATCC U-87MG 细胞与其中五个来自中枢神经肿瘤之细胞最相似,可能也是源自人类神经胶质瘤的细胞株。这让神经科学界大大地松了一口气,因为过去以 ATCC U-87MG 细胞完成的研究固然需再用其他方法验证,但仍具参考价值,堪称是不幸中的大幸!
确保体外细胞株更贴近体内生存型态
根据一篇 2015 年发表的统计,尽管大部分的研究人员知道验证所使用的细胞株非常重要,但在购买或获赠细胞株后却鲜少会进行任何验证 (注 2)。U-87MG 这 40 多年来究竟是在哪个环节出错已不可考,不过趁此机会摒弃现行使用的伪 U-87MG 细胞不见得是坏事。此外,研究显示生长于传统含有血清的培养基之神经胶质瘤细胞株,其实基因表现与原始肿瘤组织差异较大 (注 3);而相对来说,以不含血清之神经干细胞培养基培养的细胞则比较能维持肿瘤特有的表型与生长特性 (注 4)。有鉴于各国研究单位和知名学术期刊已开始要求对实验时所使用的细胞进行验证,细胞株身分鉴定和更贴近原始环境的细胞培养方式未来势必将成为趋势。现在市面上也有许多经 STR 比对认证的细胞株供研究单位购买,相信对确保实验正确性将有相当大的帮助,以免类似事件再度发生而让长时间的辛劳付诸流水。
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参考文献:
1. Allen M et al. Sci Transl Med 2016; 8:354re3.
2. Freedman LP et al. Biotechniques 2015; 59:189-90, 192.
3. Lee J et al. Cancer Cell 2006; 9:391-403.
4. Pollard SM et al. Cell Stem Cell 2009; 4:568-80.