隨著新冠肺炎(COVID-19)在全球大流行,研究人員正在爭分奪秒地開發診斷工具、疫苗和治療方法。目前約 40 多種疫苗的臨床試驗正在進行中,專家評估最快也需半年才上市。另外,多家學術機構、非營利機構和生物製藥公司也一直在利用 CRISPR技術的優勢,以增強 COVID-19 藥物的開發,並且開發快速診斷方式。

CRISPR 於 COVID-19 診斷之現況

目前,COVID-19 的檢測能力受到許多因素的限制,例如複雜程序,對實驗室儀器的需求以及對有限供應的依賴。因此,迫切需要快速檢測試劑盒。2018 年起,CRISPR 已經被科學家們開發應用於傳染病和其病原體(細菌和病毒)診斷,主要透過引導 RNA 與 Cas 家族蛋白的結合,該蛋白可切割標靶並切碎附近的 RNA 或 DNA,再透過恆溫環狀擴增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。當 CRISPR 命中目標時,報告分子釋放螢光訊號,可以透過侵入性患者檢體(例如血液、尿液或唾液)的檢測試紙來進一步對此進行分析。目前有 SHERLOCK、DETECTR 等系統已經獲得 FDA 緊急使用授權,FELUDA 獲得印度藥品總局核准使用,而 AIOD、CREST 等系統已發表於期刊,待進一步商業化。

EUA:緊急使用授權

1. SHERLOCK

SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 檢測試劑組已經於 2020 年 5 月取得美國 FDA 緊急使用授權於診斷 SARS-CoV-2,該系統主要藉由 Cas13 切割,並且可以裝載到紙條上,類似於懷孕測試,非常容易使用,可直接用肉眼觀察結果且無需昂貴設備,因此在任何環境中進行快速簡單的檢測,可在大約 1 小時內提供結果。

該檢測試劑組主要檢測 SARS-CoV-2 的開放讀序框架(open reading frame, ORF1ab,DNA上會產生蛋白質部分)基因和核殼蛋白(nucleocapsid protein, N)基因中的片段。

該系統由布洛德研究所(Broad Institute)的張峰(Feng Zhang)博士及其團隊所研發,並由其公司 Sherlock Biosciences 所發表。

2. DETECTR

由諾貝爾化學獎新科得主 Jennifer Doudna 教授和 Trevor Martin 共同創辦的Mammoth Biosciences 研發的 SARS-CoV-2 DETECTR Reagent Kit 於 2020 年 8 月底取得美國 FDA 緊急使用授權於診斷 SARS-CoV-2。

該檢測試劑組主要使用 Cas12a 進行切割,而不是 Cas9,並且結合等溫擴增以提高 attomolar 靈敏度和特異性,來檢測上呼吸道檢體中的 SARS-CoV-2 的核殼蛋白(nucleocapsid protein, N)的片段基因,將不需要複雜的實驗室環境、大型設備和耗時多步驟過程,可在 40 分鐘內提供結果。在 83 個 SARS-CoV-2 陽性檢體中,使用該檢測方法再度檢驗,其陽性預測率達 95%,陰性預測率達 100%。

延伸閱讀:Mammoth Biosciences開發第一個CRISPR疾病檢測平台

3. FELUDA

FELUDA(FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay)是由印度科學和工業研究理事會的Debojyoti Chakraborty、Souvik Maiti 和 Tata Group 所領導的研究團隊開發。他們使用 CRISPR-FnCas9 進行檢測,在不到30分鐘內可獲得檢測結果,其靈敏度為96%,特異性為98%。其中 FnCas9 對 DNA 中配對錯誤的存在以及這些錯配的位置呈現高度敏感。

他們使用生物素化的引子透過 PCR/RPA 擴增標靶序列,然後用鏈親和素(streptavidin)包覆的珠子將它們固定。再來,將包含沒有錯配的sgRNA的螢光標記dCas9複合物與固定的標靶序列結合。結合後,可以看到螢光的變化。另一種方法是將相同的概念應用於包含可與生物素化標靶(biotinylated targets)結合的鏈親和素的側流試紙條。

4. AIOD

AIDO (All-In-One Dual CRISPR-Cas12a)是由康乃狄克大學健康中心生物醫學工程系 Changchun Liu 副教授的研究團隊開發的一種「多合一雙重 CRISPR-Cas12a 檢測技術」,以使用低成本的暖手器作為培養箱,不需要昂貴電子設備,可在 20 分鐘內得到檢測結果。該檢測方法也經過 RT-PCR 驗證,能獲得一致的結果,未來可望應用在家庭或小型診所。

他們透過標靶 SARS-CoV-2 的核蛋白基因,引入了 2 個沒有原型間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)位點限制的 CRISPR RNA,以開發AIOD-CRISPR 分析,並且其能檢測具有少量拷貝敏感性的核酸。

5. CREST

CREST(Cas13-based, Rugged, Equitable, Scalable Testing)由加州大學聖塔芭芭拉分校 Maxwell Z Wilson 助理教授所開發。首先,提取 RNA 並進行反轉錄。然後使用 Taq 聚合酶通過PCR進行擴增,然後轉錄以提供 Cas13的 RNA 基質。在發現 gRNA 與給定的螢光標記基質之間存在互補性後,Cas13被活化並進行非特異性的側鏈切割。該切割與螢光可視化耦合。然而,他們沒有使用側向流動條來檢測螢光標記的RNA的裂解,而是使用了由9V電池供電的 P51 紙板螢光視覺化儀器,該電池使用藍色 LED 和橙色濾光片來檢測裂解後的螢光。整個流程,大約需要 1-2 小時。

另外,他們沒使用典型的 PCR 儀器,而是使用了價格低廉、可現場使用、支持藍牙的 PCR 儀器,它們甚至可以由電池供電,並且可以透過 DIY-Bio 機芯進行操作。

6. Jennifer Doudna 教授推新型 CRISPR- Cas13a 檢測

Jennifer Doudna 教授的實驗室近日也推出新型 CRISPR-Cas13a 檢測,僅需 5分鐘即可檢測到 SARS-CoV-2。這種高處理速度是透過避免擴增病毒基因體的需要而實現的,這項新檢測使用了針對病毒 RNA 不同部分的 CRISPR RNA 組合,並活化了每個病毒RNA的多個 Cas13a,進而增強了切割報告分子時產生的螢光信號。另外,他們可以使用手機鏡頭來測量螢光,操作簡單且易於攜帶。

利用 CRISPR 製備疫苗,可行嗎?

另一位諾貝獎化學獎新科得主法國微生物學專家 Emmanuelle Charpentier 博士提到,以目前的技術來說,透過 CRISPR 製備COVID-19疫苗,是不可能直接實現的。但是,仍可以透過 CRISPR 去了解病毒怎樣複製,間接來幫助研究團隊去開發疫苗。

延伸閱讀:CRISPR史詩級革新 病毒和腫瘤將無所遁形

參考資料:
1. https://eurowire.co/economy/321404/crispr-can-be-a-solution-to-address-the-covid-19-pandemic-roots-analysis/
2. https://sherlock.bio/sherlock-biosciences-receives-fda-emergency-use-authorization-for-crispr-sars-cov-2-rapid-diagnostic/
3. https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas
4. https://www.biospace.com/article/crispr-technology-edges-closer-to-commercial-use-/
5. https://doi.org/10.1101/2020.04.20.052159
6. https://blog.addgene.org/sars-cov-2-covid-19-detection-methods-based-on-crispr-cas
7. https://indianexpress.com/article/explained/feluda-coronavirus-covid-19-test-tata-sons-crispr-technology-6603573/
8. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.09.28.20201947v1
9. N Engl J Med 2020;383:1492-1494. DOI:10.1056 / NEJMc2026172
10. Nature Biotechnology volume 38, p870–874(2020)
11. Nat Commun 11, 4711 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-18575-6

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