『加拿大英屬哥倫比亞大學（University of British Columbia）的團隊意識到單細胞定序技術的限制，致力於革新定序流程，研發出直接樣本庫製備法（direct library preparation，DLP），省略全基因組增幅的步驟，排除增幅過程所造成的技術與人為偏誤，而且比以往使用的方式更精準可信。』
單細胞定序 真實反映細胞的獨特性
單細胞定序（single-cell sequencing）技術在 2013 年時，被《Nature Methods》期刊選為年度技術，這項技術突破了基因定序的應用，過去通常使用組織樣本或細胞群進行 DNA 與 RNA 序列分析，透過分析運算樣本細胞群取得平均值，但是這樣的方式往往無法看到細胞個體的特性。
為了真實反映每個細胞的獨特性，科學家分離出單一細胞，從中萃取遺傳物質，再以全基因組增幅（whole-genome amplification，WGA）技術製造足量遺傳物質以進行分析，單細胞基因體（single-cell genomics）被解碼之後，更揭示了細胞個體的異質性（heterogeneity），應用於癌細胞的研究，可以更精確的了解單一癌細胞的基因體以及結構變化，更能偵測罕見的細胞變異，這項技術在其他領域如：微生物學、免疫學、神經生物學、胚胎發育學、組織嵌合（tissue mosaicism）以及產前診斷都有長足貢獻。
精益求精 現行技術仍有限制
儘管單細胞定序的應用令人振奮，但仍有許多技術上的限制有待改良，其中以 WGA 為例，這是造成偏誤的主要步驟之一，因為要符合現有的定序技術，科學家必須將單一細胞基因體複製放大，以產生足夠的遺傳物質製備分析樣本庫（library preparation），常見的 WGA 技術有：DOP-PCR（degenerate oligonucleotide-primed PCR）、MDA（multiple displacement amplification）以及 MALBAC（multiple annealing and looping based amplification Cycles），各種增幅技術都有適用的情況，但不論何種方式都很難避免技術偏差，對偶基因若有異型合子的突變（heterozygous mutation），該基因無法透過聚合反應增幅而造成對偶基因丟失（allelic dropout，ADO），變異基因的偽陰性或偽陽性，聚合酶鏈鎖反應所使用的引子（primer）品質會影響增幅基因組的覆蓋率（coverage），覆蓋率不足、不一致的覆蓋率等偏誤（圖一）都使單細胞的基因序列無法被真實呈現。
圖一 單細胞序列分析常見的偏誤（a）對偶基因丟失、偽陽性或是偽陰性而造成覆蓋率不，其中 Pop 指細胞群體（a population of cell）（b）覆蓋率的度量包含覆蓋深度（coverage depth）以及總物理覆蓋率（total physical coverage），也就是覆蓋廣度（coverage breadth）（c）覆蓋一致性（coverage uniformity）隨著不同細胞而有差異。
UBC 團隊的新技術 不需全基因組增幅
加拿大英屬哥倫比亞大學的團隊意識到 WGA 技術的限制，致力於革新單細胞定序的程序，在今年一月正式於《Nature Methods》發表新的研究成果，使用直接樣本庫製備法（direct library preparation，DLP），省略了 WGA 的步驟，不進行前置增幅（preamplification），排除基因增幅過程中所產生的技術與人為偏誤，而且比以往使用的方式更精準可信。
科學家設計了一組 192 孔的微流體裝置（圖二），這套系統使用奈生（nanoliter）作為單為容積，可以直接針對單一細胞進行樣本庫製備，除了利用極微量的容積提高分析的解析度之外，可充氣的微流體分析盤能夠隨著不同的實驗需求而變化容積大小，同時還有內建的標記引子（incorporated index primers），可以直接標記單一細胞，此外獨立的影像系統讓研究人員能清楚的觀察細胞樣本。
圖二 192 孔微流體裝置示意圖
技術前景無可限量
高解析度的分析設備搭配改良的運算流程，研究團隊分析癌細胞株，將個別單細胞定序結果以電腦模擬匯合，模擬大量基因體分析的結果，得出相當一致的覆蓋率，同時更精確的偵測癌細胞的基因複製數改變（copy-number alterations，CNAs），大幅提升單細胞異質性的偵測，相較於現行的技術，新技術的花費與舊法相當，但是科學家有機會從中獲得更多資訊，讓單細胞定序的應用更有價值。
研究的主持人 Carl Hansen 博士表示，已將新技術的專利註冊並為 AbCellera 所有，AbCellera 是 Hansen 博士所領導的生技公司，主要致力單株抗體療法（monoclonal antibody therapeutics），雖然 DLP 技術與 AbCellera 的發展關聯性較低，Hansen 也因此規劃成立新公司發展商品化 DLP，不過 Hansen 相信未來可以將技術延伸應用於免疫療法，使更多人受惠於革新的技術。
文 / Joanne Shih
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參考文獻：
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3.Gawad, Charles, Winston Koh, and Stephen R. Quake. “Single-Cell Genome Sequencing: Current State Of The Science”. Nature Reviews Genetics 17.3 (2016): 175-188
4.Molika Ashford. “UBC group debuts single-cell sequencing method without whole genome amplification”. Genomeweb (2017)
5.Navin, Nicholas E. “Cancer Genomics: One Cell At A Time”. Genome Biology 15.8 (2014)
圖片來源：
1.http://en.novogene.com/wp-content/uploads/2015/10/single-cell-RNA.png
2.Gawad, Charles, Winston Koh, and Stephen R. Quake. “Single-Cell Genome Sequencing: Current State Of The Science”. Nature Reviews Genetics 17.3 (2016): 175-188
3.Zahn, Hans et al. “Scalable Whole-Genome Single-Cell Library Preparation Without Preamplification”. Nature Methods 14.2 (2017): 167-173
