麻薩諸塞大學研究團隊開發新技術，實現活細胞內三種不同mRNA的同時追蹤
RNA即時影像技術是研究基因表現、細胞功能和疾病機制的重要工具。然而，現有的技術往往存在局限性，例如只能追蹤單一RNA，或者使用的RNA標籤過長，導致RNA穩定性受到干擾，影響實驗結果的準確性。為了解決這些問題，麻薩諸塞大學阿默斯特分校（University of Massachusetts, Amherst）化學系的 Tien G. Pham、Omoyemi Ajayi 和 Jiahui Wu 組成的研究團隊，開發出一種名為「正交RNA調控的去穩定化結構域」（Orthogonal RNA-regulated destabilization domains）的新技術，能夠在活細胞內同時追蹤三種不同的mRNA，並將對RNA的干擾降到最低。這項研究成果已發表在 bioRxiv 預印本平台上，為RNA生物學和合成生物學領域帶來了新的可能性。
突破性技術：三色RNA即時影像與最小RNA干擾
這項研究的核心在於開發了兩種新的RNA調控的去穩定化結構域，分別命名為 mDeg 和 pDeg。這兩種結構域是基於廣泛使用的RNA-RNA結合蛋白對 MS2-MCP 和 PP7-PCP 改造而來。當 mDeg 和 pDeg 與螢光蛋白的C端融合時，可以將這些原本持續發光的螢光蛋白轉變為RNA調控的螢光蛋白。這意味著，只有當特定的RNA存在時，螢光蛋白才會穩定並發出螢光，從而實現對RNA的即時追蹤。
研究團隊進一步證明，MS2-mDeg 和 PP7-pDeg 可以調控多種螢光蛋白和 HaloTag 的穩定性，用於RNA影像。由於它們具有螢光性和正交性，mDeg 和 pDeg 可以與 tDeg 結合使用，在活體哺乳動物細胞中同時對三種不同的mRNA進行動態影像追蹤。
mDeg 的開發歷程
為了開發與 Pepper-tDeg 正交的 RNA 去穩定化結構域，研究團隊嘗試將 stdMCP 轉化為 MS2 調控的去穩定化結構域。他們將先前描述的 C 端 degron（Arg-Arg-Arg-Gly）融合到 stdMCP，使得在沒有 MS2 的情況下，該 degron 可以被 E3 泛素連接酶複合體識別，從而誘導蛋白質降解。然而，MS2 的結合會阻斷該 degron 被 E3 泛素連接酶複合體識別，從而抑制蛋白質降解。由於 stdMCP 的 C 端遠離 MS2 結合位點，研究團隊推斷將 Arg-Arg-Arg-Gly degron 添加到 stdMCP 的 C 端不太可能產生 MS2 調控的去穩定化結構域。
因此，研究團隊探討了在 stdMCP-CP49 和 Arg-Arg-Arg-Gly degron 之間添加一個彈性連接子是否可以提高 degron 被蛋白酶體機制的可及性，從而增加去穩定化效果。為了驗證這一點，他們構建了編碼 EYFP-stdMCP-CP49-RRRG 變體的 DNA 質體，這些變體在 stdMCP-CP49 和 Arg-Arg-Arg-Gly degron 之間包含從一個氨基酸到六個氨基酸的彈性連接子。在沒有 MS2 RNA 的情況下，每個 EYFP-stdMCP-CP49-RRRG 變體（稱為 mDeg 變體）都在 HEK293T 細胞中表達。與 stdMCP-CP49-RRRG（mDeg 變體 0）相比，隨著連接子長度從 mDeg 變體 1 增加到變體 6，黃色螢光逐漸降低，從 28% 降至 92%。這些結果表明，在 stdMCP-CP49 和 Arg-Arg-Arg-Gly degron 之間添加彈性連接子可以提高所得去穩定化結構域的降解效率。
正交性驗證
研究團隊進一步驗證了 MS2-mDeg、PP7-pDeg 和 Pepper-tDeg 之間是否具有正交性，因為三種 RNA-蛋白質對之間的正交性是在同一個細胞中同時對多個 RNA 進行影像追蹤的前提。為了測試兩兩之間的正交性，他們在 HEK293T 細胞中分別共表達了 EYFP-mDeg、EYFP-pDeg 和 EYFP-tDeg 與其同源和非同源 RNA 的所有九種可能的組合。如果 MS2-mDeg、PP7-pDeg 和 Pepper-tDeg 完全正交，那麼只有當 RNA 調控的去穩定化結構域與其同源 RNA 共表達時，才能觀察到黃色螢光。實驗結果證實了這一點，只有當 EYFP 融合的去穩定化結構域與其同源 RNA 共表達時，才能觀察到強烈的黃色螢光。每個 EYFP 融合的去穩定化結構域與非同源 RNA 共表達時，細胞中顯示的黃色螢光極少。
高效的mRNA檢測能力
研究團隊將這些標記的 mTagBFP2 mRNA 在 3’UTR 中分別進行影像追蹤，方法是在 U2OS 細胞中共表達與同源 RNA 調控的去穩定化結構域融合的 (mNeonGreen)4。為了評估每個 RNA 影像系統的性能，他們量化了在細胞質中顯示綠色螢光點的轉染細胞的百分比。在這三個系統中，使用 mDeg-MS2 觀察到顯示綠色螢光點的轉染細胞的百分比最高，達到 94%（114 個細胞中有 107 個）。與 mDeg-MS2 相比，使用 pDeg-PP7（67%，102 個細胞中有 68 個）和 tDeg-Pepper（64%，97 個細胞中有 62 個）觀察到顯示綠色螢光點的轉染細胞的百分比較低。總之，這些結果表明 mDeg-MS2 可以最有效地檢測 mRNA，而 pDeg-PP7 的性能與先前報導的 tDeg-Pepper 系統相當。
9XMS2：短標籤實現最小RNA干擾
研究團隊還發現，9XMS2 可以作為一個短標籤用於mRNA影像，而不會干擾標記的mRNA的穩定性。由於較長的RNA標籤已被證明會破壞細胞中標記的RNA的穩定性，因此使用較短的RNA標籤對於忠實地重現內源性mRNA的行為至關重要。憑藉MS2-mDeg的螢光特性和RNA影像的穩健性，研究團隊證明 9XMS2 可以用作短標籤，最大限度地減少對標記的mRNA穩定性的干擾。重要的是，這是通過利用 MS2-mDeg 的螢光特性，使用高度螢光和光穩定的螢光蛋白 (mStayGold)8-mDeg 實現的。
應用前景與未來展望
這項研究開發的兩種正交RNA調控的去穩定化結構域，為活細胞三色RNA即時影像提供了新的工具，並最大限度地減少了對RNA穩定性的干擾。研究團隊利用這些新的RNA調控的去穩定化結構域進行活細胞RNA影像，但使用已經廣泛應用的RNA適體（如MS2和PP7）來控制蛋白質穩定性的能力，可能會在RNA生物學和合成生物學領域實現眾多應用。可以想像，這裡描述的 MS2-mDeg 和 PP7-pDeg 系統可用於栓系功能分析。
研究人員表示，他們將繼續優化這些系統，提高螢光訊號的強度和穩定性，並探索其在其他生物學研究中的應用。例如，他們計劃利用這些系統研究RNA的轉運、定位和降解等過程，以及RNA在疾病發生發展中的作用。
結論
總而言之，這項研究開發的正交RNA調控的去穩定化結構域技術，為RNA即時影像領域帶來了重要的突破。它不僅能夠實現多色RNA的同時追蹤，還能夠最大限度地減少對RNA的干擾，為研究RNA的動態行為和功能提供了更準確、更可靠的工具。這項技術的應用前景廣闊，有望推動RNA生物學和合成生物學領域的發展，並為疾病的診斷和治療提供新的思路。
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原始資料來源: GO-AI-6號機 Date: December 17, 2025