預測下一個生技世代的風貌(一)：NGS次世代定序的見微知著

1995 年 11 月，美國微軟創辦人比爾･蓋茲發表新書 The Road Ahead (中文譯為《擁抱未來》)，準確預測下一個資訊世代將會是電腦無縫接軌 (seamless computing) 的時代，任何資訊都可隨時隨地以各種不同的裝置即時取得，而電腦也將從單點運作化為二維網絡，甚至可結合現實生活的人、事、物達到3D資訊結構。事實證明，比爾･蓋茲的預測在不到二十年後即全面實現，現在的智慧型隨身裝置、雲端計算、以及物聯網的發展甚至超越當時想像力的極限。而當今的生技產業正如 1995 年的資訊業，同樣有許多新技術竄出頭、有雄厚資金投入其中、有各國政府大力支持、也有大量新人才和新點子激起活力和創意。這一系列專文將大膽預測下個生技世代可能呈現的風貌，也會剖析帶動下一世代生醫發展的關鍵六大技術：NGS 次世代定序、大數據分析、蛋白質體學、液態生物檢體 (liquid biopsy)、CRISPR 基因修飾技術、以及 3D 生物列印 (bioprinting)。未來結合資訊、速度、精準度、以及病源根除工具之嶄新生醫健康產業，非常值得期待！

認識 NGS 次世代定序 (next-generation sequencing)

2003 年 04 月 14 日，人類基因體完整定序圖譜出爐，整整耗費 13 年的時間和 27 億美元的經費，才得到一組基因體序列。時間來到 2016 年，完成一個人的基因體定序僅需 26 小時和 1,500 美元，如此驚人的落差，主要是 NGS 次世代定序技術所造就。

由於 NGS 已是非常成熟的技術，相關的科研計劃及臨床運用也越來越廣泛。在科研方面，去年《Science》期刊上發表的伊波拉病毒基因，就是藉由 NGS 去分析它的起源。臨床研究方面，NGS 也常被用來做基因的篩選、檢測及治療用藥的評估，而許多實驗室及臨床計畫皆透過與經驗豐富的業界團隊合作來完成，業界提供客製化的科研服務也是近年的趨勢。尤其 NGS 產出數據的流程已經標準化，實驗設計及數據產出後的分析將扮演關鍵的角色。由 NGS 產生的大量數據動輒數十億至數千億個鹼基，在分析時從軟體選擇，參數設定、軟體串連到最後的驗證等都有相當難度。因此，有經驗的分析團隊是目前許多研究單位最缺乏，卻也是 NGS 流程中最不可或缺的。幾年前，中國華大基因可說是從科研服務起家，而台灣的 Biotools 圖爾思生物科技，近年來也提供這樣的 NGS 服務，讓許多研究單位可借重業界的數據分析經驗和團隊。在少子化的時代，尤其是實驗室人力逐漸銳減下，不失為一個不錯的選擇。

目前 NGS 技術主要有幾種：

Illumina (Solexa) NGS MiniSeq/MiSeq/NextSeq/HiSeq
Solexa 公司於 1998 年由兩位英國劍橋大學的科學家創辦，而其核心 NGS 技術的特色是將待定序的序列切成 100-150 個鹼基長的短片段後再大量複製各個片段，然後再將各片段的一端固定在平面上，以帶有螢光的鹼基進行定序。螢光鹼基結合 DNA 序列後就會發光，而電腦可捕捉這些螢光影像並同時讀取上萬片段的序列。由於每次反應只會接上一個新的螢光鹼基，所以只要讀取 100-150 個影像就能完成所有片段的定序，可大幅縮短資料讀取時間，而隨著技術的的進步被讀取的鹼基長度也更長。最後再利用電腦整合各片段的資訊，即可獲得完整的序列。Solexa 公司於 2007 年被 DNA 定序巨擘 Illumina 買下，而目前Illumina 堪稱 DNA 定序的全球龍頭，年營業額高達 16 億美金。現在全世界 90% 已定序的 DNA 序列，都是由 Illumina 的技術或機器所完成。
ThermoFisher Ion Proton/Ion PGM/Ion S5
Ion Torrent 的 NGS 技術早期屬於 Life Technologies，後來在 2014 年被 ThermoFisher 併購。這項技術是利用鹼基在定序過程結合上 DNA 序列後即會釋放一個氫離子的原理，捨棄過去以光學訊號作為讀取鹼基的基礎。ThermoFisher 的 NGS 的基本操作方式與 454 NGS 相當類似，是將待定序的序列切成 200 個鹼基長左右的小片段，然後將個別片段與單一珠子結合，再置入微量盤上的獨立凹槽進行片段複製。接下來同樣是利用一次將微量盤充滿一種鹼基的方式進行定序，但最大的差別是在於電腦會偵測氫離子釋放的訊號和數目，而不是光訊號。454 NGS 最大的弱點在於待定序片段出現一整串相同鹼基時 (例如：AAAAA)，電腦有時會分不清楚光學訊號而誤判鹼基數。不過偵測氫離子數目的 Ion Torrent 可以減少這種問題，故精準度可提升許多。
454 NGS
454 生命科學公司於 2005 年推出這項快速定序技術，是將待定序的序列切成 1,000 個鹼基長左右的大片段，再將這些片段與特殊珠料結合，每一個珠子上只會有一種片段。接下來，每個珠子將會被分到微量盤上的獨立凹槽進行片段複製作業。完成複製後，微量盤則會加滿同一種鹼基，而這些鹼基與 DNA 序列結合後就會釋放光訊號讓電腦可讀取序列。反應完成後，多餘的鹼基將會被洗掉，然後微量盤會重新充滿另一種鹼基。這種定序方式只須注意單一訊號即可，電腦不須區分四種鹼基的螢光顏色，因此定序速度可大幅提升，定序成本也可降低許多。2007 年，454 生命科學被 Roche 公司買下，不過隨著近年有更便宜而準確的 NGS 技術陸續推出，454 NGS的市占率也逐漸下滑，促使 Roche 公司宣布將於 2016 年結束這個平台，不再提供服務。

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NGS次世代定序在生技和醫療的價值

而全球 NGS 市場在 2021 年估計可達到 104 億美元的產值，主要價值在於基因序列即時偵測和大數據整合。若能立即了解特定基因甚至基因體的序列，研發各種轉殖微生物、生產單株抗體的細胞、或具有特定特徵的農作物將可大幅縮短時間並提升效率；而在臨床上，快速定序有助於診斷遺傳性疾病、判斷腫瘤類型、或是預測各種疾病的發病風險等等。而更上一層樓來看，所有這些定序的資訊若能透過大數據系統進行整合，將有助於了解每個基因的功能、基因與基因之間的互動、以及非基因的序列之功能和意義，真正地解開基因體的奧秘。

NGS 技術除了應用在基因體的範疇之外, 從轉錄體 (transcriptome，即生物個體在任一時間點真正被轉錄出來的訊息 RNA，可反應當下有在發揮功能的基因種類) 與表觀體 (epigenome，即一個基因體上的各種表觀遺傳學修飾情形，像是甲基化、乙醯化等等) 的層面進行剖析更能夠表現出生物體內的即時狀態，這有機會讓醫療真正進入「即時醫學」和「預防醫學」的時代，未來可能不只癌症，各式各樣的遺傳性疾病、慢性病、或感染性疾病，都有機會進行即時病況追蹤和治療療效評估，甚至可達到前期預防的境界。

本文末與讀者分享長庚醫院人類全基因體疾病研究核心實驗室於 2016 的演說：
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