檢測腫瘤端粒長度更快速?新穎數位即時 PCR 誕生!

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端粒是每個染色體末端的重複核苷酸序列區域,可保護末端免於降解,並且能調節染色體完整性。人類端粒由短串聯重複序列(5′-TTAGGG-3’)組成,其在出生時的長度為 8kb ~ 15kb,並且在每個複制週期後縮小 50 ~ 200 個核苷酸。在一定數量的細胞分裂後,端粒達到臨界長度,並且觸發不可逆的細胞週期停滯,稱為細胞老化。

越來越多研究證實,端粒(telomere)長度異常與糖尿病、心血管疾病等老化相關疾病以及癌症預後有關,但臨床上缺乏簡單、快速和可擴展的端粒檢測和分析技術,使其臨床應用仍有許多限制和挑戰。例如,依賴於南方點墨法(Southern blotting)的終端限制性片段(terminal restriction-fragment, TRF)分析比較麻煩,並且不適合臨床應用。此外,即時 qPCR 分析只能提供端粒長度的相對測量值,而定量螢光原位雜交(quantitative fluorescence in situ hybridization)只能評估處於分裂中期的活躍分裂細胞。肽核酸雜交方法 PHAST 需要專用設備,而且 STELA 方法還依賴於 Southern 雜交,而且很費時。

延伸閱讀:定義老化的最佳生物標記 — 端粒 (Telomere)

近日,新加坡國立大學 Lih Feng Cheow 博士的研究團隊開發出一種新穎的高通量數位即時 PCR 檢測方法(high-throughput digital real-time PCR)——單一端粒絕對長度快速分析(single telomere absolute-length rapid, STAR),可以快速測量端粒的絕對長度(0.2 kb – 320 kb)和數量。相關研究結果刊登於《Science Advances》。

該研究團隊指出,STAR 結合數位微流體設備、單細胞分析、數位 PCR 等技術來分析樣本,以便在奈米公升隔室中測量端粒重複序列的數量。PCR 擴增使得 PCR 產物的增加,同時端粒重複片段的初始長度或拷貝數也成比例增加。其中,PCR 產物的增加反應在 DNA 結合染料的螢光強度變化中,例如即時監測螢光訊號所捕獲的。此外,為了使檢測方法提供絕對長度而不是相對長度,他們使用了不同數量的已知長度的合成端粒,以生成標準曲線,可根據該標準曲線計算其他端粒長度。

為了評估 STAR 檢測端粒長度的可靠性,他們分別使用 STAR、TRF、即時 qPCR 來分析和比較 8 種癌細胞株(293T、HeLa、A549、K562、U-2 OS、WI38-VA13、NCI-H1299、Saos-2)的端粒長度。結果顯示,STAR 與 TRF 測出來的平均端粒長度之間呈現高度正相關(R 2= 0.96)。STAR 與 qPCR之間呈現中度正相關(R 2= 0.78),主要是 qPC R依賴於單拷貝基因的標準化,因此可能會由於非整倍性,而導致在許多癌症中有顯著偏差。由上述結果得知,STAR 是絕對端粒長度的可靠指標。更重要的一點是,STAR分析時間比 TRF 少 3 個小時。

再來,他們也使用 STAR 分析癌細胞的染色體外重複序列(extrachromosomal telomere repeats, ECTRs)。ECTRs 能使用同源重組的機制來保存其端粒,其數量可望反應癌細胞中端粒交替變長(alternative lengthening of telomeres, ALT)的狀態,這與患者的預後較差有關,並且可作為臨床醫師治療選擇的參考。

另外,目前 ALT 檢測方法包含 APB 檢測和 C 圈分析,但這對於 ALT 活性不是完全確定的,可能會低估腫瘤中 ALT 的發生率。因此,該研究團隊預估,整合多項 ALT 特徵檢測的 STAR 或許是能確定 ALT 狀態且更靈敏的檢測方法。所以,他們使用 STAR 來分析 4 個小兒神經母細胞瘤樣本的 ALT 狀態,發現 2 個樣本帶有 MYCN 擴增,其餘 2 個具有 ATRX 突變。其結果與先前以檢測方法得出的研究結果一致,這顯示 STAR 可望成為新穎的腫瘤端粒維持的檢測平台。

延伸閱讀:端粒 × 衰老 × 癌症

參考資料:
Science Advances; 21 Aug 2020:Vol.6, no.34, eabb7944. DOI:10.1126/sciadv.abb7944

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