登革熱是一種由蚊子傳播的病毒性疾病，在全球範圍內對公共衛生構成重大威脅。儘管大多數患者的症狀較輕微，但嚴重的登革熱可能導致登革出血熱（DHF），甚至危及生命。目前，登革熱的診斷方法通常成本高昂且耗時，尤其是在資源匱乏的地區，診斷資源更是捉襟見肘。為了解決這一問題，科學家們正積極開發更快速、更經濟、更易於使用的診斷工具。
NS1 蛋白：登革熱診斷的關鍵靶點
登革熱病毒的非結構蛋白 1 (NS1) 已被證實是早期感染階段的重要生物標記物。因此，NS1 蛋白成為開發快速診斷檢測方法的理想靶點。傳統上，NS1 蛋白的生產依賴於組織培養，但這種方法存在安全性問題、耗時且成本高昂，難以滿足大規模生產的需求。
大腸桿菌表達系統的優化
為了克服傳統方法的局限性，研究人員開始探索利用大腸桿菌 (E. coli) 表達系統來生產重組 NS1 蛋白。大腸桿菌表達系統具有成本效益高、易於操作和可大規模生產的優勢。然而，使用大腸桿菌表達系統生產具有天然結構和免疫活性的 NS1 蛋白仍然面臨挑戰。
近期一項研究發表於 Scientific Reports (2025)，詳細介紹了一種優化的大腸桿菌表達和純化方法，用於生產登革熱病毒 2 型 (DENV2) 的重組 NS1 蛋白。研究團隊成功地將編碼 NS1 蛋白的基因插入到 pET28a (+) 載體中，並在 N 端和 C 端都添加了 6x 組氨酸標籤，以提高重組 NS1 蛋白的純度。
研究人員優化了大腸桿菌 Rosetta-gami 細胞的表達條件，包括 IPTG 濃度、培養基類型、溫度和收穫時間。結果顯示，表達的蛋白大小約為 45 kDa，並通過抗 His 和抗 NS1 單株抗體驗證了表達蛋白的真實性。
NS1 蛋白的純化與復性
由於在大腸桿菌中表達的 NS1 蛋白通常會形成包涵體，因此需要進行純化和復性才能獲得具有天然構象和生物活性的蛋白。研究團隊在變性條件下純化 NS1 蛋白，然後進行體外復性和透析，以使其恢復到天然構象。
純化過程包括以下步驟：
1. 包涵體 (IB) 溶解： 將細胞沉澱物重懸於含有尿素的 IB 溶解緩衝液中，以溶解包涵體。
2. 固定化金屬親和層析 (IMAC) 純化：
利用 Ni-NTA 親和層析柱，通過 N 端和 C 端的 6x His 標籤純化重組蛋白。
3. 洗滌：
使用含有高濃度尿素和低 pH 值的洗滌緩衝液，去除與柱子非特異性結合的蛋白。
4. 洗脫：
使用含有咪唑的洗脫緩衝液，將純化的重組 NS1 蛋白從柱子上洗脫下來。
5. 復性：
將純化的 NS1 蛋白在復性緩衝液中稀釋，使其緩慢摺疊成天然構象。
6. 透析：
將復性後的 NS1 蛋白透析至 PBS 緩衝液中，去除尿素和咪唑。
研究結果顯示，該方法可以有效地生產高純度的重組 NS1 蛋白，產量約為每升細菌培養液 4.2 毫克。Western blot 分析證實，純化的 NS1 蛋白可以被抗 NS1 和抗 His 單株抗體識別，表明該蛋白具有良好的免疫反應性。
側向流動免疫分析 (LFA) 的設計與應用
側向流動免疫分析 (LFA) 是一種快速、簡便且經濟的診斷技術，廣泛應用於即時檢測 (POCT)。LFA 的原理是利用毛細作用驅動液體樣品在試紙條上流動，並通過抗體或適體等生物分子與靶標物結合，產生可視化的信號。
適體-抗體三明治 LFA 的開發
為了提高 LFA 的靈敏度和特異性，研究團隊設計了一種基於適體-抗體三明治結構的 LFA 檢測方法。該 LFA 試紙條包含以下幾個關鍵組件：
1. 抗體捕獲區： 試紙條上固定有針對 NS1 蛋白的抗體，用於捕獲樣品中的 NS1 蛋白。
2. 結合墊：
結合墊上含有與金納米粒子 (AuNPs) 連接的適體，適體可以特異性地結合 NS1 蛋白。
3. 控制區：
控制區固定有生物素標記的互補適體，可以與鏈黴親和素結合，形成可視化的控制線。
在檢測過程中，如果樣品中存在 NS1 蛋白，它會首先與抗體捕獲區的抗體結合，然後與結合墊上的適體-AuNP 複合物結合，形成三明治結構。這種複合物會沿著試紙條流動，並在控制區被生物素標記的互補適體捕獲，產生一條可視化的檢測線，表明結果為陽性。
LFA 的性能評估
研究團隊評估了 LFA 檢測 DENV2 NS1 蛋白的性能。結果顯示，該 LFA 可以在緩衝液中檢測到低至 5.2 ng/mL (95% CI: 4.6–5.8) 的 NS1 蛋白。
適體在側向流動檢測中的應用
除了抗體，適體 (Aptamer) 也是側向流動檢測中重要的生物識別元件。適體是具有特定三維結構的單鏈核酸（DNA 或 RNA）寡聚物，可以通過分子識別與目標靶標結合。與抗體相比，適體具有化學合成效率高、保質期長、易於修飾等優點，使其成為理想的生物識別元件。
適體 LFA 的優勢
靈敏度高：
適體可以通過 SELEX（配體指數富集系統進化）技術篩選出高親和力的適體，提高 LFA 的靈敏度。
特異性強：
適體可以針對特定的靶標分子進行設計，減少交叉反應，提高 LFA 的特異性。
穩定性好：
適體具有良好的化學穩定性和熱穩定性，可以在較寬的溫度範圍內保持活性。
易於修飾：
適體可以通過化學修飾引入各種功能基團，例如熒光基團、金納米粒子等，用於信號放大和多重檢測。
結論與展望
總體而言，這項研究成功地開發了一種基於大腸桿菌表達系統的重組 NS1 蛋白生產方法，並將其應用於適體-抗體三明治 LFA 的設計。該 LFA 具有快速、簡便、靈敏度高等優點，有望成為登革熱早期診斷的有力工具。
然而，該研究仍存在一些局限性，例如僅針對 DENV2 進行了驗證，未在臨床樣本中進行評估。未來的研究可以進一步優化 LFA 的性能，擴大其應用範圍，例如開發多重 LFA，同時檢測多種登革熱病毒血清型，或將 LFA 與智慧手機等移動設備結合，實現現場快速診斷。此外，還可以探索使用適體完全替代抗體，開發更經濟、更穩定的適體 LFA。
隨著生物技術的發展，基於 NS1 蛋白的快速診斷檢測方法將在登革熱的防控中發揮越來越重要的作用，為患者提供及時的診斷和治療，降低疾病的發病率和死亡率。
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原始資料來源: GO-AI-6號機 Date: December 1, 2025