见微知菌—利用基因体定序寻找未知微生物

研究显示，地球上约存在一兆种以上的微生物，目前还发现不到百分之的物种一 [注 1]。但那些未知的物种不一定只存在于难以到达的高压深海或是灼热火山中，它们很可能正在眼前的鼠标键盘以及您身体的里里外外开心过活，只是我们还没有发现而已……

从培养皿到核酸定序：见微知著功力的提升

传统研究微生物的方法多是以分离培养得到单一物种的方式来探究其特性，但是未知微生物往往因生长条件不明而无法培养。研究人员之前也利用 16S rRNA 基因广泛存在于几乎所有生物，但序列会随不同物种而有若干变异的特性，针对 16S rRNA 基因设计各种共同引子定序样本中的 16S rRNA 基因，如此一来便能得知样本是否包含新物种 [注 2]。不过这样的方法虽然比分离培养有更高的敏感性，但因为只针对一种基因进行分析，故仅可发现新物种的存在，无法理解其构造或生理功能。

总体基因体学：拼图游戏

随着定序技术的进步，科学家已可利用总体基因体学 (metagenomics) 工具同时对样本中数不清的微生物进行定序，得到庞大的片段资讯后再与数据库比对，进而拼凑出个别物种的基因体。总体基因体学最大的优点是能够在毫无头绪的情况下揪出来源不明的基因并循线发掘新种微生物，亦能补足只靠定序 16s rRNA 所缺少的其他基因资讯。目前各地的研究团队已用此方法发现上千种过去无法培养的新菌种，著名例子包括从人类口腔 [注 3] 及土壤 [注 4] 发现的 TM7、同样也在口腔发现的 SR-1 [注 5]、附着于水槽水管内的 TM6 [注 6]、来自无含氧泉水的 OP11 [注 7]、以及存在于温泉底部堆积物的 OP9 等 [注 8]。不过定序方法也存在一大缺点，因为从一个样本定序出来的结果可能包含成千上万种微生物所贡献的上兆种基因片段，故必须花费大量时间及人力建构基因数据库并设计可比对及拼组基因片段的程式才能得到有意义之结果，挑战性依然很高。

单细胞定序：锁定目标

为了更精确分析单一种类微生物的基因体，研究人员致力于减少定序所需的细胞数，到现在甚至只要一颗细胞便能定序。现在已经能以细胞分类技术分离出单一细胞后，再使用 MDA (multiple displacement amplification，MDA) 或 MALBAC (multiple annealing and looping-based amplification cycles) 等方法进行定序。

MDA reaction steps，来源：https://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_displacement_amplification

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MDA 技术和一般 PCR 的不同点在于其引子为随机六码核苷酸，故几乎能从任意位置开始复制；其特殊 Phi 29 核酸聚合酶在复制过程中，亦可将所遇到的其他复制片段从模板 DNA 剥离后继续前进，而分离出来的片段又会被引子接上并展开另一次复制与分离，周而复始形成大量分支状 DNA。经过多次循环达到目标数量后，便能用 S1 核酸酶切断分支处形成无分支 DNA，再进行后续定序工作。其优点为基因体覆蓋率高 (单一人类细胞可达 99% [注 9])，但因经常遗漏对偶基因 (allelic dropout) 且引子间容易发生交互作用，故判读结果时须特别留心。

MALBAC 则借由设计特殊引子，使第二轮复制成品头尾相接成环而无法再做为模板进行下一次复制，进而改善传统复制过程容易延续上一次错误的情形，让成品更能贴近原始 DNA 序列。MALBAC 经过特殊引子复制五轮后，会用一般引子进行传统 PCR 增加片段总数，再定出完整序列。与 MDA 相比，MALBAC 的基因体覆蓋率在单一细胞虽较低 (单一人类细胞约 93% [注 10])，且因前五轮所用之复制酶出错率稍微较高，故往往须 2-3 颗细胞以上才能获得最精确的成果；但由于侦测突变的伪阳性与伪阴性率低、不易遗漏对偶基因、以及侦测单核苷酸多型性 (SNP) 效率较高的优点，与 MDA 各有千秋。而且得到初步基因体序列后，其实就能回头与总体基因体多头定序得到的诸多片段进行比对，拼凑出其完整度和正确度甚高的 DNA 蓝图。

由此即可推估未知微生物的构造、生命运作机制、以及与周遭环境的互动关系，或进而发掘富有潜力的抗生素、抗癌药、及具有应用价值之化学物质等。在 99% 的未知物种当中，想必存在许多极富运用价值的基因或蛋白质。一想到还有那么多未知领域等待发掘，您的探究精神是否也跟着燃烧起来了呢？

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参考文献：
1. Locey KJ & Lennon JT. Proc Natl Acad Sci USA 2016; 113:5970-5.
2. Woese CR et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:4576-9.
3. Marcy Y et al. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104:11889-94.
4. Podar M et al. Appl Environ Microbiol 2007; 73:3205-14.
5. Campbell JH et al. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110:5540-5.
6. McLean JS et al. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110:E2390-9.
7. Youssef NH et al. Appl Environ Microbiol 2011; 77:7804-14.
8. Dodsworth JA et al. Nat Commun 2013; 4:1854.
9. Paez JG et al. Nucleic Acids Res 2004; 32:e71.
10. Zong C et al. Science 2012; 338:1622-6.
11. Ling LL et al. Nature 2015; 517:455-9.

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