癌细胞与人类医学检测竞赛，如何应用液态活检突破检测困境？

液态生物检体 / 液态活检 (liquid biopsy) 曾被 MIT Technology Review 评选为 2015 年的十大突破性科技，透过采集血液、唾液、尿液等体液检体，检测受试者体内的特定生物标记，可作为非侵入式产前检测（NIPT）、疾病早期筛检、伴随诊断、动态监控、癌症复发预测与预后评估等多种用途。具有方便、即时且低侵入性的优点，比起传统侵入式采样，更能提高受试者的接受度，近年相关研究与应用越发广泛、应用于临床检测分析势不可挡。

液态活检提供癌症诊断与监控新方向
液态检体应用的三大方向为：循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、循环血液核酸（cell free DNA, cfDNA）以及胞外体或细胞外囊泡 (circulating exosomes 或 extracellular vesicles)。其中，又以 CTCs 和 cfDNA的应用较为成熟，CTCs 纯化技术最早出现 (1990 年出现)，而 cfDNA/ctDNA 的临床应用则是到 2007–2008 年次世代基因定序技术（new generation sequencing, NGS）问世后开始突飞猛进。随着 NGS 技术的进步，以液态活检代替实体肿瘤切片，已是近年来癌症临床应用的热门趋势。传统的肿瘤组织活检（tissue biopsy）透过针吸或手术采集样品，为侵入式的检验，对患者而言，不仅检测风险高、体力消耗大，且会因采样部位的不同而有差异，进而导致治疗评估失准、影响预后等问题。而液态活检仅需提供病患的体液作为检体，为非侵入性或低侵入性采样，可降低对病患的伤害、提高方便性、降低采样成本，为无法进行组织切片的病患（例如身体状况不适合开刀、肿瘤位于脑部、血管等采样有安全疑虑区域等）提供另一项新选择。

临床上，液态活检多采用即时聚合酶链锁反应（real-time PCR, RT-PCR）或微滴式数字聚合酶链锁反应（digital droplet PCR, ddPCR）等技术进行检测。两者皆是使用已知的变异位点来设计探针，侦测检体中的突变位，作为医师评估、诊断与开立处方的参考依据。RT-PCR可即时在电脑监测实验结果、大幅缩短检测时间。而 ddPCR 则能精确地测定核酸的DNA分子个数，相较其他检测仅能相对定量，ddPCR 能做到绝对定量的准度。然而，探针的设计无法包含所有基因变异的图谱，因此可能缺少较不常见的临床相关突变鉴定力，同时也限制了对其他新兴生物标记的检测。若改由 NGS 方式进行检测，则可更全面、完整的综观整体变异。

检测极微量 ctDNA，选对工具很重要！
1940年代，科学家从血液中发现了cfDNA 的存在，正常细胞在体内代谢更替、破裂时，会释放出所有胞内物质，DNA也由细胞内游离进入血液中，成为 cfDNA。一般来说，这类游离出来的 DNA 会被巨噬细胞清除，然而，当游离 DNA 的生成速度大过清除率时，则有可能持续存在于血液中，比如来自肿瘤细胞的 DNA。而 cfDNA 中确实也带有肿瘤细胞凋亡后释出的循环肿瘤核酸（circulating tumorDNA, ctDNA），因此透过血液检测 ctDNA，即可追踪癌细胞存在与否，且检测 ctDNA的变异，亦可作为肿瘤诊断、对症下药的参考依据。此外，循环 DNA 的半衰期短，因此 ctDNA 的组成也会随着肿瘤进展而改变，可即时、准确且敏感的呈现肿瘤消失、扩散与复发等状态。尽管利用液态活检辅助癌症诊疗是医疗检验上的一大突破，却仍旧面临许多挑战，比如：
一、肿瘤异质性（tumor heterogeneity）：因癌细胞异质性高，游离出来的部分 DNA 并无法代表所有细胞特性、描绘出肿瘤的全貌，因此在检测结果上的判读必须更谨慎保守。
二、技术的纯化与灵敏度问题：早期肿瘤释出的 ctDNA 量更低，除非检测技术在纯化与灵敏度上有更进一步的突破，否则较难应用于早期肿瘤的侦测。

如何提高检测精确度？正确采样与样本 QC 为关键！
由于 ctDNA 的量极少，在血液中约只占 cfDNA 的百万分之一，因此在检测过程中，纯化与侦测的灵敏度，便成为其中的关键。本文从 cfDNA 应用于检测所需经过的四大步骤：取样、纯化、侦测、分析，分别简介各步骤及在品管 (QC) 上的注意事项：
一、取样及保存（sampling / preservation）：液态活检的取样为低侵入性，具有方便、即时之优点。但在保存上因 cfDNA 半衰期短，且在采样、运输、保存过程亦可能导致有核细胞破裂、释放出 genomic DNA，干扰后续检验的精准度，而使用专门的保存管，则可有效降低 cfDNA 的降解、维持其他细胞完整性、提高保存品质。
二、纯化（purification）：由于 ctDNA 含量少，纯化更需下功夫。一般市面上的纯化产品，可依纯化方法区分为磁珠法（magnetic beads）或膜柱法（silica membrane）。磁珠法的原理为提供适当环境，让 DNA 吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面，借此方式收集 DNA，并在后续用洗脱的方式让 DNA 与磁珠脱离，达到纯化的目的。膜柱法则是使用含硅滤膜作为核酸的特异性吸附材料，透过盐类及pH值的调整改变滤膜对核酸的吸附能力。两者间的差异主要在于回收率。在纯化一般 DNA 时差异不大，然而因为 ctDNA 极度微量，因此与磁珠碰撞结合机率低，膜柱法则如同网鱼般能够一网打尽，较占优势。
三、侦测（detection）: 纯化后的 ctDNA 可依检测需求，搭配 microarray、PCR、qPCR、ddPCR、NGS 等方式侦测。在上机前，样本的 QC 也是确保检测准确度的一大关键，母亲的血液中可能带有来自胎盘的胎儿 DNA，中风或是心脏病患者的血液中也可能带有DNA片段，除样本基本浓度测定外，使用高灵敏性的毛细管电泳技术(capillary electrophoresis, CE) ，例如： BiOptic Inc. 的 Qsep 系列、Advanced Analytical Fragment Analyzer 或Agilent Bioanalyzer，确认样本片段的大小（一般 ctDNA大小应落于160~200bp之间），可以排除 genomic DNA或 carrier RNA 污染的可能性。
四、分析（analysis）：尔后再进行数据分析，将其利用于医疗诊断、辅助上。

‘工欲善其事，必先利其器’，选对武器与工具，在对抗疾病等无形的敌人，才能更占优势。液态活检是迈向临床精准医学的重要一步，也为癌症医疗带来革命性的转变，不仅用于伴随诊断、动态监控，更可追踪癌症复发与预后。疾病变化万千，医学界也期待能有更多抗衡疾病的武器，因此单就检测疾病存在与否已不能满足医疗所需。科学家正尝试将 ctDNA 与蛋白质标记做连结，试图透过此方法将液态活检的检测结果回溯癌症发生位置、或是利用液态活检分辨哪些癌症需要即时处理、哪些则否。期待未来，有意义的液态活检应能比传统检测更精准、全面、灵敏。应能在无症状的人群中检出早期癌症病患、同时亦能确认癌症发生位置以及是否需要治疗。善用工具、灵活运用技术，将能为患者带来更多益处。

撰文 / Alma Wu
审稿 / Thomas Huang、 Jane Lee