堪稱本世紀最大的生物技術發現 ― CRISPR，讓基因的修飾、剪輯、或插入易如反掌。由細菌抵抗病毒感染的防衛系統所衍伸而來的 CRISPR，本質上就是利用導引 RNA 序列鎖定細胞內的目標序列，再以 Cas9 核酸酶進行剪輯。如此一來，因為基因發生突變、出現缺陷、複製數 (copy number) 太多所造成的先天性疾病，未來都可望透過 CRISPR 而獲得解決。發現 CRISPR 功勞最大的三位科學家：Emmanuelle Charpentier、Jennifer Doudna、和 Feng Zhang 確實貢獻卓著，並同時獲得 2016 年唐獎的生技醫藥獎。
表觀遺傳學的問題可否透過 CRISPR 解決？
基因序列出現問題，固然可透過 CRISPR 進行編輯而獲解決；但如果基因序列沒有問題，而是基因表現發生異常，該怎麼辦？表觀遺傳學泛指影響基因表現的各種後天修飾，其中最常見的表觀遺傳修飾之一為 DNA 甲基化 (methylation)。構成 DNA 的腺嘌呤 (adenine, A) 和胞嘧啶 (cytosine, C) 鹼基可被甲基化，不過 adenine 甲基化只會在細菌等原核生物發生。而在所有脊椎動物，cytosine 的甲基化會造成該基因的表現受限，無法產生相對應之蛋白質。若該基因原先會促進某種生理反應，甲基化會使基因表現蕭條，生理反應就無法正常進行；舉例來說，甲基化會緩和動脈平滑肌細胞的再生，最後會使血管壁失去彈性而逐漸硬化，進而引發心血管疾病。相對來說，若被甲基化的基因原先負責抑制某種生理作用以免身體過度反應，甲基化就會讓該生理反應失控；例如癌症的發生就與腫瘤抑制基因的甲基化有密切關係。目前已知 21 世紀所有重大文明病 ― 癌症、糖尿病、心血管疾病、腦血管疾病、老化相關併發症等等，全部都與甲基化有密切關聯性。所以當生物醫學界體認到 CRISPR 編輯基因的潛力後，研究人員積極想解明的下個問題就是：CRISPR 可否修飾 DNA 甲基化？
CRISPR 可用來甲基化 DNA
在 2016 年春天，克羅埃西亞札格雷大學的研究團隊1和美國華盛頓大學聖路易分校2的研究團隊分別發表可將 DNA 甲基化的 CRISPR 系統。兩個團隊都是利用失去功能的 Cas9 核酸酶結合 DNA 甲基化酵素 DNMT3A 的活性單位，再搭配導引 RNA 送入細胞。結果顯示這樣的系統可針對目標序列周邊 35-50 個鹼基對的 DNA 進行甲基化，成功率在 50% 以上。後續分析也顯示被甲基化的基因之表現也確實被降低1,2。研究人員設計這樣的系統是希望建立模擬甲基化相關疾病的細胞或動物模型，但其成果也間接證實 CRISPR 系統搭載甲基化相關酵素確實可對目標基因序列發生作用。下一步，當然就是要將 CRISPR 系統搭配去甲基化酵素，挑戰未知。
CRISPR 也可用來將 DNA 序列去甲基化
中科院上海生命科学研究院生物化學與細胞生物學研究所的團隊在 2016 年 5 月隨即發表以 Tet1 去甲基化酵素結合失去功能的 Cas9 核酸酶，成功在人類子宮頸癌細胞株 (HeLa) 針對目標 DNA 序列進行去甲基化3。研究團隊選擇使用 Tet1，是因為這是比較小巧的去甲基化酵素，所以比較容易送入細胞。研究結果也顯示送入該系統後，目標基因的 mRNA 表現量即可提高 5-60 倍，效果非常顯著3。之後在 2016 年 9 月，美國麻省理工學院的 Rudolf Jaenisch 實驗室也發表以 Cas9 搭配 Tet1 或 DNMT3 的 CRISPR 系統，在實驗小鼠身上成功進行目標基因序列的甲基化和去甲基化4。Rudolf Jaenisch 教授是德裔美國人，在 1974 年與 Beatrice Mintz 共同建立了史上第一組基因轉殖小鼠，因此被封為「基因轉殖鼠之父」。近年來，Jaenisch 教授積極投入表觀遺傳學的研究，而這次發表的 CRISPR 甲基化–去甲基化系統不僅有機會讓他再被封為「表觀遺傳小鼠模型之父」，更顯示 CRISPR 可在活生生的哺乳類動物進行目標基因序列的去甲基化。這也表示表觀遺傳學相關疾病亦可望透過 CRISPR 獲得解決，對於癌症治療、文明病的改善、甚至老化的逆轉都有重大意義。
去甲基化得永生？
先前也有美國杜克大學醫學中心的研究顯示，失去功能的 Cas9 核酸酶可結合乙醯轉移酵素 (acetyltransferase) p300，針對目標基因周邊的組蛋白 (histone) 進行去乙醯化，進而促進該基因的表現5。有了可進行甲基化、去甲基化、和去乙醯化的 CRISPR 工具，表觀遺傳疾病的研究將會突飛猛進，而屆時若先天性疾病和後天性疾病都能直接進行基因體修飾而解決，人類會經歷一場前所未有的健康和醫學革命！不過這之中還有更驚人的可能性：目前已知人類胚胎細胞在發育的過程會逐漸分化為各器官的專業細胞，這個過程的關鍵就是 DNA 甲基化。同理，幹細胞在發展為體細胞的過程中，亦有特定基因發生不可逆的甲基化，這也是為什麼體細胞不會再回溯成為幹細胞。而隨著體內幹細胞逐漸轉為體細胞而消耗殆盡，人體器官的損耗就沒有細胞可以填補，久而久之就會老化，最後個體就會死去。但是如果 CRISPR 系統可將這些特定基因去甲基化，或許體細胞就有機會回溯為幹細胞，讓身體的再生能力源源不絕，長保青春。也許永恆的秘密，就藏在去甲基化之中…
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──黃富楠／「基因線上」總編輯
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參考文獻：
1. Vojta A et al. Nucleic Acids Res 2016; 44:5615-28.
2. McDonald JI et al. Biol Open 2016; 5:866-74.
3. Xu X et al. Cell Discov 2016; 2:16009.
4. Liu XS et al. Cell 2016; 167:233-247.e17.
5. Hilton IB et al. Nat Biotechnol 2015; 33:510-7.
