腺相关病毒（Adeno-associated viral, AAV）广泛使用在基因疗法作为载体，传递目标基因，因具备安全性、大组织趋向（broad tissue tropism）、低致病性以及高效且稳定的传递方式，被视为基因疗法中的黄金标准。
目前为止，美国 FDA 仅核准 2 种 AAV 载体基因疗法，一是 Novartis 治疗脊髓性肌肉萎缩症的 Zolgensma，二是 Spark Therapeutics 治疗莱伯氏先天性黑蒙症的 Luxturna，但仍有不少针对多种疾病的候选 AAV 载体基因疗法如雨后春笋冒出。依照现有研究进展速度，FDA 预估直至 2025 年将新增 10 至 20 个细胞与基因疗法取得核准。另外，根据调研机构 Fortune Business Insights 的统计，基因疗法的市场规模将于 2027 年成长至 356.7 亿美元，相比 2019 年的 36.1 亿美元，将迎来大幅度成长。
AAV 载体最大挑战：人体免疫反应
AAV 载体在强大优势的背面仍有许多应用挑战，其中最令人头疼的就是病毒载体进入人体所引发的免疫反应。人体有一种会辨识外来入侵分子，借此激发先天与后天免疫反应的样式辨识受体（pattern recognition receptor, PRR），而类铎受体（Toll like receptor, TLR）中的 TLR2 与 TLR9 蛋白会将病毒载体的外壳与 DNA 设定为外来入侵，使接受基因疗法的患者产生严重的免疫介导毒性。
举例来说，美国生技公司 Audentes Therapeutics 于 2020 年 8 月宣布基因疗法临床试验中出现第 3 个死亡案例。受试者死因是由败血症产生的进行性肝脏失调，他们当时都接受高剂量的 AAV 载体基因疗法 AT132，治疗 X 染色体遗传肌小管病变（X-linked myotubular myopathy）。
此外，在动物模型中，也有研究指出高剂量的基因疗法会使其产生严重的肝脏毒性。
合成生物学之父创业解决 AAV 载体应用挑战
而为了找出更安全的 AAV 载体应用模式，全球生技企业群起研究。其中，合成生物学之父暨连续创业家 George Church 博士和其实验室中的博士后研究员 Ying Kai Chan ，于 2018 年创立的新创 Ally Therapeutics 受到各界瞩目，并已接连获得来自 ARCH Venture Partners、Alta Partners 和 UCB ventures 等著名创投的种子轮融资，公司目标在于开发安全性更高的 AAV 载体与免疫原性更低的基因疗法。
抑制 TLR9 蛋白，降低免疫反应风险
George Church 博士带领在哈佛大学医学院与 Wyss 研究所的团队于 2 月 10 日发表一个大型研究的成果，内容刊登于《Science Translational Medicine》。值得一提的是，该合作也是基因疗法、视觉科学、合成生物学的跨领域合作，汇集如哈佛大学医学院 Constance Cepko 博士等学界专家合作。
研究团队将包含抑制 TLR9 序列的短 DNA 寡核苷酸（short DNA oligonucleotides）编入 AAV 载体的基因中，使 TLR9 难以辨识出序列较长的 AAV 载体，借此降低免疫反应的产生。他们将之称为联结免疫调节（coupled immunomodulation）。
于初期细胞培养试验中，研究人员发现，编辑后的 AAV 载体比未编辑版本更可弱化初级免疫细胞的先天性免疫反应。且注射入小鼠、猪 2 种动物模型的肝脏、肌肉与眼睛组织时，编辑后的 AAV 载体都表现出降低先天性免疫反应与 T 细胞免疫反应的结果。
Ally Therapeutics 现任科学长 Ying Kai Chan 博士表示，透过把抑制 TLR9 的片段放入 AAV 载体中，或许可让 AAV 载体在进入人体后能逃脱免疫系统的侦测机制。
在免疫细胞浸润少的眼睛表现如何？
许多基因疗法研究从免疫细胞浸润较少的眼睛进行试验，结果发现从眼睛直接进行基因疗法的方式会造成眼内炎症，而从眼球玻璃体注射虽然侵入性较低，但却更容易导致发炎。
而 Ally Therapeutics 的试验结果指出，在小鼠的动物模型中，从玻璃体注射经编辑改造过的 AAV 载体所产生的发炎症状会比未编辑版本来得低，且使视网膜的报导基因（reporter gene）表现高；类似情形也出现在猪的动物模型，当研究人员在下视网膜注射编辑后 AAV 载体，发现没有出现不良反应，但未编辑版本却会。
但产生发炎的机制不只一种
但并非所有动物模型都是相似结果。猕猴模型在注射编辑后 AAV 载体仍出现眼睛发炎症状，这代表有除了 TLR9 之外的发炎机制，且系统须进一步优化。
Constance Cepko 博士指出，从 AAV 载体引发的玻璃体内毒性、表现的 TLR9 抑制性、和对胆固醇的反应可看出，让注射位置出现中毒现象的机制不只 TLR9 一种，未来团队将持续研究和了解不同种机制。
Wyss 创始董事 Donald Ingber 博士表示，在合成生物学、视觉科学、基因疗法的跨界合作之下，AAV 载体的编辑技术将开创出一条新的研究道路，而这也将把基因疗法推往更安全、更有效率的方向。
作者：Rajaneesh K. Gopinath
编译：Tyler
参考资料：
1. https://geneonline.news/en/george-churchs-new-startup-engineers-aav-vectors-that-evades-host-immune-responses/
2. https://stm.sciencemag.org/content/13/580/eabd3438
3. https://wyss.harvard.edu/news/a-new-vision-for-aav-delivered-gene-therapies/
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