CRISPR基因编辑教母-珍妮佛道纳(Jennifer A. Doudna) 访台演讲

基因编辑 (Gene Editing)，这项革命性的科学发明，近年来在全球的基础研究与应用掀起遍地烽火，受到史无前例的关注。第 13 届 Sunney Chan Lecture 特别邀请 CRISPR 基因编辑教母珍妮佛道纳 (Jennifer A. Doudna) 教授再次造访台湾在中央研究院进行演讲，讲述《CRISPR生物学如何引领基因编辑的未来 (CRISPR Biology Guides the Future of Genome Editing)》，将 CRISPR-Cas9 系统的过去与未来完整地做了完美的诠释。

误入夏威夷丛林的小女孩毕生投入基因体研究

Sunney Chan Lecture 主席 Sunney Chan 教授在引言时介绍，Jennifer A. Doudna出生于美国华盛顿特区，生长于一个充满学术气息的家庭，父亲和母亲分别在英国文学和东亚历史拥有博士与硕士学位，并分别都在大学与学院任教，是名符其实的书香门第。因为父亲任教工作的关系，在她七岁时举家迁移到夏威夷，夏威夷岛上丰富且独特的生物型态，引发了童年时期的她对生物学的好奇和兴趣，更在她心中埋下了科学研究的小小种子。到了中学时期，从她父亲赠与诺贝尔奖得主詹姆士华生 (James Watson) 的著作《双螺旋：发现DNA结构的故事 (The double helix)》获得启发，深深对这完美对称的双股螺旋结构当中的生命奥秘所吸引，进而投身于生物科学研究领域。

在她大学求学时期分子生物学的中心法则（The central dogma of molecular biology）的逻辑刚被确认，RNA 被认为是很单纯的遗传讯息传递物质，但后来科学家们发现 RNA 并非完全按照DNA密码转译而成，而是具有许多非转录/转译的功能性结构，进而引发她的兴趣投入 RNA领域，长年投入钻研 RNA 相关的细胞分子机转研究。

Jennifer 受邀于第13届 Sunney Chan Lecture 演讲

因缘注定遇见妳与CRISPR的不解之缘

Jennifer A. Doudna 教授回忆起 2006 年时，在加州大学柏克莱分校 (University of California, Berkeley) 同事班菲尔德 (Jillian Banfield) 的引领之下首度认识了 CRISPR，让她开始对于这个发生在古微生物的有趣现象感到兴奋且深深着迷，但实际上当时她因为研究室的资源和人力不足，险些放弃了这项崭新而高风险的 CRISPR 研究。在班菲尔德 (Jillian Banfield) 的强力鼓吹之下，再加上团队有新的博士后研究员威登赫夫特 (Blade Wiedenheft) 的加入，让她决定放手一搏，决心投入探索 CRISPR 神秘机转的谜团。

2011年，CRISPR 研究发生了巧妙的化学变化，在一场国际研讨会的场合 Jennifer A. Doudna 教授因缘际会认识了法国的微生物学家伊曼纽夏彭提耶 (Emmanuelle Charpentier)博士，两人相谈甚欢一拍即合地决定开始合作。Emmanuelle Charpentier 从化脓性链球菌的感染机制确认是以第 II 型 CRISPR 系统来切断病毒 DNA，其中 csn1 基因扮演非常关键的角色 (Csn1 曾有过许多名字，直到 2011 年夏天才被正式命名为 Cas9)。她们一致认为 Cas9 蛋白可能在第 II 型 CRISPR 系统的免疫反应期间，担任破坏病毒 DNA 的关键要角。

CRISPR 的全名是“常间回文重复序列丛集／常间回文重复序列丛集关联蛋白/群聚且有规律间隔的短回文重复序列”（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins），主要为一种存在于大多数细菌与所有的古细菌中的后天免疫系统，负责消灭入侵的外来质体或者噬菌体，在所有原核生物的重复 DNA 序列中 CRISPR 似乎是最为普遍的一种重复 DNA 序列家族。CRISPR-Cas 基因编辑系统是由两段 RNA (CRISPR RNA 和 tracrRNA) 和切割酵素酶蛋白 (Cas9) 所组成的复合式结构，CRISPR RNA 和 tracrRNA扮演着导航者的角色，带领着 Cas9 蛋白复合体找到病毒的 DNA序列进而将其切割分解。2002 年，扬森 (Ruud Jansen) 所带领的研究团队以英文字母缩写组合出 CRISPR 的称号来为这区段命名。CRISPR / Cas 的复合式结构包含两个部份，第一个是 CRISPR，这是一段排列奇特的 DNA；第二个是 Cas，是一种核酸酶。这两者组合起来就成为一套 DNA 编辑系统。

CRISPR-Cas 基因编辑的3D打印模型

基因编辑的圣杯 CRISPR/Cas9 带起研究应用狂潮

Jennifer A. Doudna 教授说明在基因编辑系统中 CRISPR RNA 是一段约 20 个核苷酸长度的 RNA 序列，透过序列互补来辨认目标 DNA 的位置，让 Cas9 蛋白进行双股 DNA 切割裂解 (Double Strand Break)，进而透过细胞本身的自然 DNA 修复机制或是给予人工的外源 DNA 片段作为模板，对于目标 DNA序列进行修补或是编辑。2012年，她与美国加大柏克莱分校的同事 M. Jinek 和 Emmanuelle Charpentier 合作，尝试把 CRISPR RNA 和 tracrRNA 接合起来，变成一条合成的单股 RNA，称 sgRNA，大幅简化了制作 CRISPR / Cas9 的过程。该研究成果旋即发表在《Science》期刊，并且在隔年的一月份发表了 CRISPR 基因编辑在人类细胞的研究成果，不仅奠定 CRISPR/Cas9 成为基因编辑的重要里程碑，更点燃 CRISPR 基因编辑研究/应用领域群雄并起的烽火。

Jennifer A. Doudna 教授认为，CRISPR-Cas9 系统具有的三大特性，使得其机转和应用逐渐受到重视:

可控制/编辑欲锁定的目标 DNA 序列。
能在基因体当中进行快速地扫描与编辑。
不仅在基因编辑能够使用，还能用于基因转录的控制 (Transcription control) 甚至侦测细胞中特定基因变异位点的存在与否，用途非常广泛。

除了 Cas9 系统，她的研究团队还试图探寻是否还有新的 CRISPR 系统的存在，2017年她和 Burstein 教授团队合作，证实在微生物体当中还有其他的 CRISPR 机制存在: CRISPR–CasX 和 CRISPR–CasY。实验证实 CasX 确实能在 CRISPR 系统发生作用，可能将是继 Cas9 之后另外一个具有潜力作为基因编辑应用的工具，值得进一步的研究探讨。

Jennifer A. Doudna 教授在演讲中也不讳言地直接点出，基因编辑应用在临床医疗所面临的挑战包括: CRISPR 系统和模板 DNA 的传递效率、如何精准地控制 DNA 修复的途径和道德伦理的争议。目前已经在研究 (Reaserch)、健康照护 (Healthcare)、治疗 (Therapeutics) 、农业 (Agriculture) 和诊断 (Diagnostics) 等六大领域开展了许多的应用。

研究领域方面，运用 CRISPR 基因编辑技术来探讨蝴蝶翅膀的颜色与型态变化，或从基因演化的角度来研究古代尼安德塔人的脑部发育和现代人类的脑部差异。器官移植也是 CRISPR 基因编辑健康照护方面很有意义的应用，由于猪只与人类的体积相近，是非常好的器官移植捐赠来源，但来自于猪只本身的反转录病毒（Porcine endogenous retrovirus），具有感染并插入人体细胞 DNA 的风险，可能造成无法预料的 DNA 突变风险。近年来有研究团队运用 CRISPR/Cap9 的基因编辑方法将器官组织的细胞重新编程（Reprograming）来弱化内生性的反转录病毒活性，让异种移植 (Xenotransplantation) 的可行性又向前迈进一大步。在疾病治疗方面，CRISPR 在一些重大的单基因遗传病例如: 亨丁顿舞蹈症 (Huntington’s Disease) 的治疗上从老鼠的动物实验当中也获得了重大的进展，相关的神经退化疾病: 例如帕金森氏症（Parkinson’s disease）或阿兹海默症（Alzheimer’s disease）未来也有机会透过此机制作为治疗策略。在农业方面，有研究团队将 CRISPR 应用于蕃茄种植，将 MADS 基因序列转殖到植株当中，能有效地提升作物的产量，将可能有助于人类减缓粮食不足的危机。在临床诊断方面，麻省理工学院 (MIT) 的张锋（Feng Zhang）教授团队运用 Cas12a 的 CRISPR 系统开发出一种能够侦测特定基因序列的检测方法，透过萤光标记将侦测到特定基因序列的反应呈色，能够广泛使用在 SNP 位点的侦测、肿瘤的早期筛检、细菌感染源检测、抗生素的抗药性反应和病毒感染源检测等方面，由于试纸轻便携带方便且容易检测，未来有机会应用于定点照护检测（Point of Care Testing, POCT）的疾病筛检与诊断。

面对基因编辑的伦理争议研究之路任重而道远

由于道德伦理争议的禁锢，基因编辑的应用目前大多仅止于动植物的活体实验或人类细胞的体外实验当中获得印证，要进一步在人体进行实验或应用，仍有许多问题需要被克服。

Jennifer A. Doudna 教授说明，基因编辑可分为体细胞编辑 (Somatic cell editing) 和生殖细胞编辑 (Germline cell editing) 两个层级，造成的影响和道德伦理争议有很大的区别。体细胞编辑 (Somatic cell editing) 的基因修饰多用于特定部位的疾病治疗，影响只限于细胞或是局部组织，并不会造成系统性的变化，也不会遗传到下一代，所面临的医学伦理争议较小。然而，生殖细胞编辑 (Germline cell editing) 则是在受精卵仍在胚胎初期时就进行基因编辑，将整个胚胎的基因序列做整体性的改变，能够将确定致病的基因突变序列直接矫正成为正常的基因序列，有效地根除单基因遗传疾病或遗传性的致病突变 (例如BRCA基因变异遗传)，产生永久性的影响，进而衍生出基因订制宝宝的议题。

生殖细胞编辑进而衍生出基因订制宝宝的议题

Jennifer A. Doudna 教授解释，透过基因编辑来订制宝宝以当今的科技还是没有办法做到，因为有许多生理特征是同时受到多个基因的作用影响，而且特征与基因序列之间的关联性并未清楚地被建立，但却能够透过先进的胚胎基因筛检/诊断和基因编辑技术，帮助许多深受基因遗传疾病所苦的民众和家族。创新科技的进展快速，对于人类社会与地球环境的发展确实有可能成为双面刃，她期许未来 CRISPR 基因编辑的应用能够朝向受控制且良善的应用发展，造福广大的民众。

Jennifer 教授与中研院 PI 们欢乐合影

延伸阅读：CRISPR 先驱张锋现身唐奖讲座侃谈微生物于基因编辑之应用及发展

注记:

注1: 发现 CRISPR/Cas9 机转与应用的三位科学家:法国的伊曼纽．夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier）、美国的珍妮佛．道纳（Jennifer A. Doudna）与华裔美籍的张锋（Feng Zhang），共同获得 2016 年唐奖生技医药奖的殊荣肯定。

注2: CRISPR / Cas 系统可概略分成三大类：Type I、II、III。其中 Type I、III 只需要 crRNA 就可以找到病毒 DNA；而 Type II 则需要 crRNA 和 tracrRNA 合作才能找到。不过Type I、III系统，如果要切断目标 DNA 的双股序列，就需要 8 种 Cas 蛋白参与，机转相当复杂；而Type II 系统仅需要一种 Cas 蛋白（Cas9）参与，且在 crRNA 和 tracrRNA 的双重引导之下能够精准地锁定目标 DNA 序列，因此 CRISPR/Cas9 成为基因编辑最主流的工具。

文 / John Hung

参考文献:

A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.
RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2013 Jan 29;2:e00471.
New CRISPR–Cas systems from uncultivated microbes. Nature. 2017 Feb 9;542(7640):237-241.
CRISPR takes on Huntington’s disease. Nature. 2018 May;557(7707):S42-S43.
Bypassing Negative Epistasis on Yield in Tomato Imposed by a Domestication Gene. Cell. 2017 Jun 1;169(6):1142-1155.
Guide-bound structures of an RNA-targeting A-cleaving CRISPR-Cas13a enzyme. Nat Struct Mol Biol. 2017 Oct;24(10):825-833.
Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017 Apr 28;356(6336):438-442.
Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018 Apr 27;360(6387):439-444.
Human Genome Editing. Science, Ethics, and Governance (2017)
《基因编辑大革命：CRISPR如何改写基因密码、掌控演化、影响生命的未来》Jennifer A. Doudna, Samuel H. Sternberg 天下文化出版