2017 诺贝尔生理医学奖：掌管昼夜律动的生理时钟

是否曾好奇，是什么让你从台湾飞到美国当晚，明明很累却睡不着，等到白天明明该醒著的时候，又困得恨不得地上一躺就沈沈睡去？但很奇妙的，过几天以后便可以与当地的人们一同作息，等到束装回国后，又要再来一次“调时差”？

是“生理时钟”（circadian rhythm）。生活在地球上的我们，由于地球大约每 24 小时自转一次，让我们的生活有了昼夜之分；为了配合昼夜轮替的世界，我们的基因表现也需要“配合演出”，才能让自己完美地生存在这个世界！可是，人体共有超过两万个基因，这些基因当然不可能个别一一对昼夜环境变化进行反应，而是透过俗称的“时钟基因组”（clock genes）来调节全身上下所有的基因表现。

2017 诺贝尔生理医学奖颁给了美国的霍尔（Jeffrey C. Hall）、罗斯巴希（Michael Rosbash）和杨恩（Michael W. Young）对动物如何调节生理时钟机制的研究，他们以果蝇（Drosophila melanogaster）为材料，发现果蝇的生理时钟调节乃是透过包含 PER（PERIOD）、TIM（TIMELESS）、DBT（DOUBLETIME）等几个主要的基因来进行的。

虽然调节生理时钟机制的研究是在果蝇中被详尽的研究，但大家有所不知的是，最早的生理时钟研究其实是从菜豆（Phaseolus vulgaris）开始的喔！

生理时钟研究的起源

1729 年法国天文学家迪米宏（Jean Jacques d’Ortous de Mairan，1678-1771）注意到暗室中的含羞草叶片依然在早晨会打开、夜晚闭合；但他仅仅将这个现象给记录下来，并没有做更多的研究。直到大约一百五十年后（1875），德国植物生理学家菲佛（Wilhelm Pfeffer，1845-1920）以菜豆为材料，从 1875 年直到1915 年发表了许多关于菜豆叶片运动的文章。甚至为了观察方便，他还设计了一个纪录叶片运动的仪器。

法国科学家迪米宏研究示意图。来源：Nobelprize.org

他发现只要他把菜豆放在连续黑暗足够长的时间之后，便可使菜豆的叶片运动消失。接下来重新让菜豆接受光-暗循环时，他可以让菜豆“学会”在他提供的昼夜循环时间进行叶片运动、甚至可以让菜豆日夜颠倒。当时他的结论是：生理时钟可以经由学习而来。但因为其他人发现，不论之前将植物暴露在怎样的光-暗长度循环下，只要回到连续光照的状况，菜豆很快就会回到一天24小时的生理时钟。于是他最后下了结论：生理时钟应该是内生性的、更可能与基因有关。

后来班宁（Erwin Bünning，1906-1990）的实验进一步发现，生理时钟的确与基因有关。不论亲代生长于如何的昼夜节律下，子代还是维持大约 24 小时的生理时钟；而他对植物光周期（photoperiodism）的研究，更进一步支持生理时钟的确由基因控制。

这些成果的累积，使本泽（Seymour Benzer，1921-2007）与他的学生克洛普卡（Ronald J. Konopka，1947-2015）在 1960-70 年代开始以甲磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）处理果蝇后，找出生理时钟异于常“蝇”的突变种。当时他们找到三只突变果蝇，后来证实都是同一个基因突变：PER（PERIOD）。

当时克洛普卡对这些突变果蝇进行了不少研究，但因为技术上的限制，PER 基因直到 1984 年才被杨恩和霍尔与罗斯巴希两个团队由果蝇中选殖出来，而真正的研究突破要直到在 1980 年代后期–它的抗体被做出来以后。有了抗体，科学家们发现 PER 蛋白与 mRNA 在夜间达到最高，但 mRNA 的高峰领先蛋白 6-8 小时。

接着研究团队发现，原来 PER 是个可以进出细胞核的蛋白质，当它在细胞内的量逐渐上升时（ZT4~ZT12，定时器时间 [zeitgeber time]，ZT0 开灯、ZT12 关灯），便开始与 TIM 蛋白结合、进入细胞核，接着它会将已经连结在在自己的启动子上的 CLK 蛋白（CLOCK）磷酸化。这使得 CLK-CYC 双体离开 PER 启动子上的 E-box，于是 PER 的表现便被抑制了（ZT18~ZT4）。在开灯（ZT0）后 TIM 蛋白开始分解，这使得 PER 蛋白可以被 DBT 蛋白磷酸化而后分解，于是 CLK 蛋白磷酸化程度降低，又开始可以与 PER 基因的启动子结合、于是 PER 基因的表现又开始上升了。

为什么 PER mRNA 出现后 6-8 小时 PER 蛋白的量才开始上升呢？那是由于 DBT 蛋白会将 PER 蛋白给磷酸化的缘故。由于这几个蛋白质之间相互的转录-转译反馈回路（TTFL，Transcription-Translation Feedback Loop），使我们体内许多基因得以随着昼夜循环不息。

PER 基因调节示意图。来源：Nobelprize.org

而当年本泽与克洛普卡找到的三只 PER 基因突变果蝇，其中有一只呈现生物时钟完全混乱的状态，后来发现就如他们预测的，这果蝇的 PER 基因有所谓的“无义突变”（nonsense mutation）；而另外两个生物时钟周期长度比一般果蝇长或短的，则是“错义突变”（missense mutation）。由于 PER、DBT、CLK、TIM 等基因互相影响彼此的表现，研究团队也发现，PER 突变也会造成 TIM 失去节律性等等。

延伸阅读：生物时钟与肠道菌有什么关连？

牵一发而动全身的“时钟基因组”

其实这些时钟基因不只是我们自己体内的基因表现与否，近几年的研究也发现，CLK 与肠道菌节律也有很大的关连喔！剔除 CLK 与 BmalI 基因的小鼠，肠道菌就失去节律了。由此可知，以 PER、TIM、DBT 以及 CLK 等基因所组成的“时钟基因组”，控制着我们体内、体外许许多多基因的表现与物种的兴替，可说是“牵一发而动全身”！至于菲佛最早观察到的“学习”行为，其实是透过光受器蛋白（photoreceptor）输入光的信号来调整生物时钟的方式。虽然在飞机发明之前，除了搭海啸的便车以外，生物们并不会经常有跨洲旅行的机会；但随着四季更迭，昼夜长短还是会有些改变，因此生物除了内生性的生物时钟以外，接受外来的信号进行必要的调整，当然也是不可或缺的囉。

发源于植物领域的生物时钟研究在二十世纪开启之后，最近一、二十年因为发现轮班工作者的代谢问题也与生物时钟有关后，让这个领域受到更多的重视。当年默默观察黑暗中的含羞草叶片运动的迪米宏、以及费尽苦心发明仪器纪录菜豆叶片运动的菲佛若有知，应该也会觉得开心吧！

文 / 叶绿舒

参考文献：
W.G. Hopkins and N.P.A. Hüner, Introduction to Plant Physiology. 3rd eds. p.424
Scientific Background Discoveries of Molecular Mechanisms Controlling the Circadian Rhythm. The Nobel Assembly at Karolinska Institutet.
P.E. Hardin. 2011. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv. Genet. 74, 141-173.

图片来源：
Nobelprize.org

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