超越 CRISPR？新颖基因编辑 Retron 诞生！| GeneOnline News

在基因编辑中，CRISPR-Cas9 为当今最著名的技术之一。它比以前使用的技术更准确，并且具有广泛的潜在应用，包含各种单基因遗传性疾病治疗。然而，要大量交付 CRISPR-Cas9 材料仍然很困难，以及切割 DNA 双股的分子剪刀 Cas9 可能会切错位点，导致脱靶效应，进而发生不可逆且不可预期的伤害。

近日，哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的研究团队建立了一种新的基因编辑工具 Retron Library Recombineering（RLR）。RLR 使用细菌 DNA 片段 Retron，来产生单股 DNA 片段。它透过在细胞复制其基因体时引入另一种DNA来执行诱饵转换，进而有效地产生基因变异而不会破坏 DNA。RLR 同时生成多达数百万个变异，并“编码”变异细胞，以便可以一次筛选整个文库，进而可以轻松生成和分析大量数据，使科学家们同时进行数百万个基因实验。相关研究结果刊登于《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

Retron Library Recombineering

由于 Retron 在细菌中有产生单股 DNA 的能力，该研究团队开始研究其基因编辑功能。

他们为了确认能否透过 Retron 来完成有效重组，他们首先建立了细菌DNA的环状质体，该质体包含位于 Retron 序列中的抗生素抗药性基因，以及一个单股黏合蛋白（single-stranded annealing protein, SSAP）基因，可以将 Retron 序列整合入细菌基因组。他们将这些 Retron 质体插入到大肠杆菌（E. coli ）中，以查看在 20 代细胞复制后该基因是否成功整合到其基因组中。最初，少于 0.1％的带有 Retron 重组系统的大肠杆菌掺入了所需的变异。

再来，为了改善起始状况，他们对细菌进行了几项基因调整。首先，他们使细胞的天然错配修复机制失去活性，因此可以在将其遗传给下一代之前固定所需的突变。他们还抑制了 2 个编码外切核酸酶的细菌基因，外切核酸酶会破坏游离浮动的单股 DNA。这些变化极大地增加了整合 Retron 序列的细菌比例，达到了总数的 90％以上。

既然确信其 Retron单股 DNA 已整合到细菌的基因体中，再来他们就测试了是否可以将 Retron当作基因定序的捷径，进而可以在混合物中进行许多实验。因为每个质体都有自己独特的Retron，可以充当“名称标签”，他们认为它们应该能够对短得多的 Retron 序列进行定序，而不是对整个细菌基因体进行测序，进而确定细胞已产生哪些突变。

他们也测试了 RLR 是否可以检测到大肠杆菌中已知的抗生素抗药性突变。他们发现，与其他突变相比，包含这些突变的序列在其定序数据中的存在比例要高得多。另外，他们还确定 RLR 具有足够的灵敏度和准确度，可以量测由非常相似突变所引起的抗药性的微小差异。此研究的关键点在于，透过对整个细菌文库中的条形码进行定序而不是对单一突变体进行分离和定序来收集这些数据，可以极大地加快这一过程。

再来，他们想知道 RLR 是否可以用于随机片段化的DNA，并找出它们一次可以使用多少个 Retron。他们切碎了对另一种抗生素具有高度抵抗力的大肠杆菌菌株的基因体，并利用这些片段建立了包含在质体回溯序列中的数千万条基因序列的文库。然后，他们将该文库引入 RLR 优化的大肠杆菌菌株中进行分析。他们再一次发现，通过对细菌库进行定序，它们相对于其他细菌富集的事实可以很容易地辨识出赋予抗生素抗药性的 Retron。