TALED 基因編輯工具,開創粒線體基因編輯的時代來臨!

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韓國基礎科學研究所基因工程中心的研究人員,開發了一種新的基因編輯平台TALED(transcription activator-like effector-linked deaminases ),能夠在粒線體中進行 A 到 G 鹼基轉換編輯。這項令人振奮的新發現,被認為是基因編輯技術中最後的臨門一腳。

CRISPR-Cas 藉由編輯基因組突變,開啟治療新道路

從 1968 年發現了第一個限制酶、1985 年發明了聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 、 2013 年 CRISPR 基因編輯,到近期的 TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease),生物技術的每一個新發現與突破,都進一步提高了人類改變世界的能力。

CRISPR 基因編輯可能有安全疑慮?(基因線上國際版)

粒線體基因變異導致疾病

粒線體,即所謂的「細胞發電廠」,是細胞中的微小胞器,主要是由外膜、內膜與基質組成,負責供應細胞能量。由於它是能量代謝的重要細胞器,如果發生突變,就會引起與能量代謝相關的嚴重遺傳疾病。

執行研究的基因組工程中心主任Kim Jin-Soo說:「由於粒線體的DNA缺陷,會出現一些極惡劣的遺傳性疾病。例如,導致雙眼突然失明的Leber氏遺傳性視神經病變(Leber hereditary optic neuropathy, LHON),是由粒線體 DNA 的一個單點突變。」它會讓患者的視線由一個小白點的遮蔽,逐漸擴散為大範圍的白霧狀,直到視線完全被遮蔽,目前醫學上尚無法有效治療這種神經退化性的遺傳疾病。目前全世界的盛行率不明,而英國北部及芬蘭的盛行率大約1/30,000~1/50,000。

另一種粒線體常見的基因疾病,乳酸血症和類中風症狀的腦病變 (mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes, MELAS),是一種影響身體許多系統的疾病,特別是大腦、肌肉和神經系統。患者通常於2-10歲間陸續出現疾病相關的臨床表徵,可能包括肌肉無力和疼痛、反覆頭痛、食慾不振、嘔吐和癲癇發作。大多數患有MELAS的人體內都有乳酸堆積,這種狀況稱為乳酸酸中毒,因血液酸度增加而導致嘔吐、腹痛、極度疲倦、肌肉無力和呼吸困難等症狀。

編輯粒線體 DNA 的技術演進

我們的基因一半來自父親、一半來自母親,唯獨粒線體 DNA 一定來自母親,因為在受精的過程當中,精子的粒線體基本上不會進入卵子。粒線體 DNA 中有 90 種已知的致病突變點,至少 5,000 人中的 1 人受此影響。

由於向粒線體傳遞基因方法受到限制,許多現有的基因組編輯工具無法使用。 例如,CRISPR-Cas 平台不適用編輯粒線體中的突變,因為引導 RNA 本身無法進入胞器。Kim Jin-Soo補充說道:「另一個問題是缺乏粒線體疾病的動物模型。因目前無法設計出建立動物模型所需的粒線體突變,使得開發和測試這些疾病的治療方法變得非常困難。」

圖片來源/ Cell 期刊

2020 年,由哈佛大學布羅德研究所( Broad Institute )和麻省理工學院的 David R. Liu 領導的研究人員設計了一種新的鹼基編輯器,名為 「DddA 」衍生的胞嘧啶鹼基編輯器 (derived cytosine base editors, DdCBEs),它可以從粒線體中的 DNA 進行 C 到 T 的轉換。這是透過建立一種新的鹼基編輯技術,將單個核苷酸鹼基轉換為另一個鹼基而不破壞 DNA。然而,這種技術僅限於 C-to-T 轉換,而且主要限於 TC,使其成為有效的 TC-TT 轉換器。這意味著它只能修正 90 個中的 9 個( =10% )確認的致病性粒線體點突變。

TALED 能進行 DNA A-to-G 轉換

這篇公布於Cell研究的第一作者 Cho Sung-Ik 說:「為了克服這些限制,我們能夠建立了一個名為 TALED 的新型基因編輯平台,以實現 A-to-G 轉換。新平台擴大了粒線體基因編輯的範圍,不僅可以建立疾病模型,也可以為開發治療做出重大貢獻。」值得注意的是,僅能夠在人類 mtDNA 中進行 A 到 G 轉換就可以糾正 90 種已知致病突變中的 39 種(= 43%)。

研究人員融合三個不同的成分創造了 TALED。 第一個成分是轉錄類活化因子效應遺傳因子 (transcription activator-like effector, TALE),它能夠瞄準 DNA 序列。第二個成分是 TadA8e,一種促進 A 到 G 轉換的腺嘌呤去氨酶。第三個成分 DddAtox 是一種胞嘧啶去氨酶,它使 TadA8e 更容易接近 DNA。有趣的是研究團隊發現 TadA8e 能夠在具有雙股 DNA 的粒線體中進行 A 到 G 編輯,和過去所知 TadA8e 是一種僅對單股 DNA 具有特異性的蛋白質不同。Kim Jin-Soo表示,以前沒有人想過使用 TadA8e 對粒線體進行鹼基編輯,因為認為它應該只針對單股 DNA。這種跳出框架的思維模式,幫助拓展了新的領域。

研究人員推測,DddAtox 允許通過極短的時間窗口打開雙股,讓 TadA8e,這種快速酶進行必要的編輯。除了調整 TALED 的成分外,研究人員還開發了一種能夠同時進行 A-to-G 和 C-to-T 鹼基編輯以及僅 A-to-G 鹼基編輯的技術。他們透過建立包含所需粒線體 DNA(mtDNA)編輯的單細胞衍生複製,來展示這項新技術。此外,因 TALED 既沒有細胞毒性,也不會導致 mtDNA 不穩定,脫靶效應也很少,研究人員希望透過提高編輯效率和特異性來進一步改進 TALED,為胚胎、胎兒、新生兒或成年患者引起疾病的 mtDNA 突變,開創新的道路。 

延伸閱讀:故障的「細胞發電機」?第一個活體內基因編輯治療粒線體疾病

參考資料:

  1. http://www.tfrd.org.tw/tfrd/library_b2/content/category_id/1/id/954
  2. https://phys.org/news/2022-04-era-mitochondrial-genome-begun.html

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