美国基因与细胞治疗学会（American Society for Gene and Cell Therapy，ASGCT）第 25 届年会上，“日本细胞和基因治疗的新兴研究”论坛中，来自日本专家分享在细胞和基因治疗的专业知识，以及日本在相关研究的最新发展实例。除了肿瘤学和遗传病之外，日本的生物医学界正致力于开发新疗法，并以特定组织为目标，提高基因疗法的效率。
ASGCT 2022 看 FDA、EMA 对于基因疗法的未来监管动向？（基因线上国际版）实现心血管疾病的基因治疗
九州大学药学研究院的米满吉和（Yoshikazu Yonemitsu）博士回顾了治疗心血管疾病的 RNA 疗法的演变，以及大规模双盲随机临床试验，在评估细胞疗法疗效降低偏见和误差方面的重要性。现今大多数基因治疗候选药物主要是针对肿瘤和遗传疾病，但在治疗心血管疾病的临床成功例子则非常有限。
米满博士分享了 DVC-0101 的临床试验结果，这是一种以 RNA 为基础的基因疗法，用于治疗周边动脉疾病（Peripheral artery disease，PAD）。这种疾病是由从心脏向双腿输送血液的血管阻塞引起，会导致肢体血流不足，情况严重者甚至会发生组织坏死，令患者需要接受截肢手术，切除坏死的腿部或脚趾以保存性命。
研究团队的治疗设计来自于编码重组仙台病毒（recombinant Sendai virus，rSeV）中的人类成纤维细胞生长因子（human fibroblast growth factor）基因。重组仙台病毒是一种小鼠 RNA 病毒，可用于靶向气道上皮细胞。
根据临床前资料评估，使用该病毒作为载体具有外源蛋白的高表达、安全性、有效性和低毒性等优势。I/IIa 期临床试验表明，在 PAD 患者中单次肌肉注射 DVC-0101 具有良好的安全性和疗效，患者的肢体状况和行走能力都有所改善。然而，根据 IIb 期的资料，研究未能达到改善肢体运动和行走表现的主要目标，尽管没有发生与药物有关的重大不良事件，但结果表明需要更稳健的临床试验设计来测试基因疗法。
利用 transposon 改良 CAR-T 细胞疗法
CAR-T 细胞疗法（Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy）很大程度上扭转了血液肿瘤治疗上的劣势。然而，对于实体肿瘤而言，由于缺乏肿瘤特异性抗原的恶劣肿瘤环境，加上 CAR-T 细胞难以穿透肿瘤，CAR-T 的免疫反应仍然难以发挥。
为了改善 CAR-T 在实体肿瘤中的传递和疗效，京都府立医科大学的柳生茂希（Shigeki Yagyu）博士展示了一个转座子介导的 CAR-T 系统（transposon-mediated CAR-T system）。由于免疫原性较低且价格低廉，利用转座子在实现稳定基因转移方面是一种有吸引力的选项。此外因为不需要 T 细胞启动、有利的记忆样表型（memory-like phenotype）以及能够防止 T 细胞衰竭，转座子具有强大免疫启动的额外优势。转座子的可能缺点是转染效率（transfection efficiency）较低，转座酶的选择和基因转移方法的具体细节对效率影响很大。
柳生博士介绍了他的研究团队在优化转座子介导的 CAR-T 细胞设计方面的工作。他们设计了 PiggyBac (PB)-CAR-T 细胞，使用静止的 T 细胞、原始的 PB 转座酶（PB transposase）、优化的电穿孔（electroporation）技术和 T 细胞扩增实验方案，尽量提升 CAR-T 细胞的活力，并改良其表型、功能和安全状况。这些 CAR-T 细胞都在多个临床试验中进行了安全性和 T 细胞扩增测试。利用 PB-HER2-CAR-T 细胞在动物模型中测试活性，团队可以确定它们在针对实体肿瘤的抗肿瘤治疗方面的潜在应用。
接下来团队将会开始对 PB-HER2-CAR-T 细胞进行治疗妇科肿瘤的临床试验。柳生博士又提到进一步的改进是加上 CD45RA 抗原作为标记物，研究发现这样可以令 T 细胞扩增幅度提高约 50%。透过整体优化设计、减少了基因组整合，可以解决在个别 PB-CAR-T 细胞临床试验中观察到的 CAR-T 细胞淋巴瘤。随着更多的功能研究，转座子介导的 CAR-T 细胞治疗将有望变得更安全。
改造病毒载体以改善基因在肝脏的传递
自治医科大学的村松慎一（Shin-ichi Muramatsu）博士展示了一种将腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体利用于肝病小鼠模型，治疗鸟胺酸氨甲酰基转移酶缺乏症（Ornithine Transcarbamylase (OTC) Deficiency）的基因疗法。OTC 缺乏症是一种遗传性代谢疾病，由于患者体内 OTC 酶缺失，尿素循环受损，导致排泄氨的能力下降，继而引致高血氨和对中枢神经系统造成损害。
AAV 载体可将基因校正分子传递到不同类型细胞的 DNA 中，是基因疗法领域中一种非常有效的传递工具。村松博士的团队设计出 AAV3 载体，以抵抗灵长类动物的中和抗体并将这些抗体清除。载体的蛋白质外壳（capsid）经过修改以减少与抗体的结合，在体外和体内的试验中均大幅度改善了载体在人类肝细胞的转导（transduction）。
团队为此研究开发了一个 OTC 的人类化小鼠模型，结果显示 AAV3-OTC 基因疗法可让肝脏中的 OTC 水平得到恢复，血液中的氨含量减少，肝脏的组织病理学得到改善，但没有产生明显的毒性。这表明改良型 AAV3 更有效地将基因传递至肝细胞，有望逆转单基因肝病。
超越血脑屏障的基因沉默
东京医科齿科大学脑神经内科主任教授横田隆德（Takanori Yokota）博士介绍了将含有DNA-RNA 混合体的异源双链寡核苷酸（Heteroduplex oligonucleotides，HDOs），应用于基因沉默（gene silencing）的技术。HDO 可以与蛋白质、脂质、抗体或其他物质结合起来进行传递。他展示了多项关于 HDO 介导的基因沉默的概念验证研究，例如将 HDO 与 α-生育醇（α-tocopherol）接合，可以靶向肝脏并沉默肝脏中的基因，效率远比使用反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASOs）更高。
横田博士提到优化 HDO 设计可应用于调节几乎所有组织的基因表达。研究团队发现若要穿过血脑屏障，胆固醇是最佳的传递配体。他们以大脑的多个区域为目标检验了 HDO 的效率，结果发现在不破坏血脑屏障的渗透性的前提下，HDO 可使目标 RNA 的表达沉默 70-90%，与在小鼠模型中观察到的情况一致。通过多次静脉注射，HDO 在大脑的所有细胞类型中均可达致长期基因沉默，而在小胶质细胞（microglia）中观察到的效果最好。
总结而言，讲者介绍了日本最近在细胞和基因治疗的最新发展，包括药物靶点、输送系统、以及导向至特定组织的技术，这些研究工作可以为研发新一代治疗方法提供参考，从而解决多种不同疾病的医疗需求。
作者：Sahana Shankar
编译：Richard Chau
原文：Cell and Gene Therapy Landscape in Japan is Moving Beyond Oncology
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