提升 CRISPR 效率,Repair-seq 篩選工具突破技術瓶頸!

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基因編輯是現今先進的療法之一,其中 CRISPR 技術發現者去年因此獲得諾貝爾獎。儘管 CRISPR 被廣泛應用基改作物、動物,也有許多人體治療案例,但基因編輯仍難以避免脫靶效應(off-target),這會使得基因產生非預期的突變。

普林斯頓大學(Princeton University)團隊近期連續刊登於《Cell》兩項研究,提出一種名為「Repair-seq」篩選工具,藉由分析 DNA 修復機制,有效提升 CRISPR 編輯效率及精準度。

Repair-seq 結合 CRISPR 分析 DNA 修復機制

當 DNA 損壞時會啟動自動修復機制,這項機制也跟基因編輯有關,因為破壞雙股 DNA 即是基因編輯的第一步驟,一旦過程有失誤就會造成意外的突變。

為了了解修復 DNA 損傷的機制如何改善基因編輯效率,研究團隊先以 CRISPR/Cas9、Cas12a 工具破壞 DNA 結構,接著再透過 repair-seq 篩選出不同的 DNA 修復機制。

在 476 個篩選出與 DNA 修復有關的基因中,包含 DNA1MCM10 參與基因片段修復的機制。其他完整的基因圖譜也可在線上資料庫搜索。

Prime editing 篩選出干擾 DNA 修復途徑  

研究團隊也應用麻省理工學院(MIT)提出的 prime editing 技術,prime editing 只切割單股 DNA。該技術同樣利用引導 RNA 將 Cas9 結合至標靶位點,在 DNA 被破壞之後,研究團隊再一一關閉 476 個與 DNA 修復功能有關基因,並以 repair-seq 檢視分別造成的影響。

結果顯示核酸錯誤配對修復(mismatch repair)機制,會阻擋 prime editing 作用,該團隊也設計出能暫時關閉這項功能的表現蛋白 MLH1dn。

研究負責人 Adamson 教授提到,repair-seq 可以大量呈現基因編輯工具造成的影響。而只要能迴避掉特定 DNA 修復途徑(如:核酸錯誤配對修復),將能大幅提升基因編輯效率。

延伸閱讀:用 CRISPR 編輯腸道菌!微生物療法降低癌症免疫療法副作用

參考資料:
1. Cell, 2021; https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)01176-4
2. Cell, 2021; https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)01065-5
3. https://www.princeton.edu/news/2021/10/20/princeton-led-studies-boost-crispr-gene-editing-prospects

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