TALED 基因編輯工具，開創粒線體基因編輯的時代來臨！

韓國基礎科學研究所基因工程中心的研究人員，開發了一種新的基因編輯平台TALED（transcription activator-like effector-linked deaminases )，能夠在粒線體中進行 A 到 G 鹼基轉換編輯。這項令人振奮的新發現，被認為是基因編輯技術中最後的臨門一腳。

CRISPR-Cas 藉由編輯基因組突變，開啟治療新道路

從 1968 年發現了第一個限制酶、1985 年發明了聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 、 2013 年 CRISPR 基因編輯，到近期的 TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease），生物技術的每一個新發現與突破，都進一步提高了人類改變世界的能力。

CRISPR 基因編輯可能有安全疑慮？（基因線上國際版）

粒線體基因變異導致疾病

粒線體，即所謂的「細胞發電廠」，是細胞中的微小胞器，主要是由外膜、內膜與基質組成，負責供應細胞能量。由於它是能量代謝的重要細胞器，如果發生突變，就會引起與能量代謝相關的嚴重遺傳疾病。

執行研究的基因組工程中心主任Kim Jin-Soo說：「由於粒線體的DNA缺陷，會出現一些極惡劣的遺傳性疾病。例如，導致雙眼突然失明的Leber氏遺傳性視神經病變（Leber hereditary optic neuropathy, LHON），是由粒線體 DNA 的一個單點突變。」它會讓患者的視線由一個小白點的遮蔽，逐漸擴散為大範圍的白霧狀，直到視線完全被遮蔽，目前醫學上尚無法有效治療這種神經退化性的遺傳疾病。目前全世界的盛行率不明，而英國北部及芬蘭的盛行率大約1/30,000～1/50,000。

另一種粒線體常見的基因疾病，乳酸血症和類中風症狀的腦病變 (mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes, MELAS)，是一種影響身體許多系統的疾病，特別是大腦、肌肉和神經系統。患者通常於2-10歲間陸續出現疾病相關的臨床表徵，可能包括肌肉無力和疼痛、反覆頭痛、食慾不振、嘔吐和癲癇發作。大多數患有MELAS的人體內都有乳酸堆積，這種狀況稱為乳酸酸中毒，因血液酸度增加而導致嘔吐、腹痛、極度疲倦、肌肉無力和呼吸困難等症狀。

編輯粒線體 DNA 的技術演進

我們的基因一半來自父親、一半來自母親，唯獨粒線體 DNA 一定來自母親，因為在受精的過程當中，精子的粒線體基本上不會進入卵子。粒線體 DNA 中有 90 種已知的致病突變點，至少 5,000 人中的 1 人受此影響。

由於向粒線體傳遞基因方法受到限制，許多現有的基因組編輯工具無法使用。例如，CRISPR-Cas 平台不適用編輯粒線體中的突變，因為引導 RNA 本身無法進入胞器。Kim Jin-Soo補充說道：「另一個問題是缺乏粒線體疾病的動物模型。因目前無法設計出建立動物模型所需的粒線體突變，使得開發和測試這些疾病的治療方法變得非常困難。」

2020 年，由哈佛大學布羅德研究所( Broad Institute )和麻省理工學院的 David R. Liu 領導的研究人員設計了一種新的鹼基編輯器，名為「DddA 」衍生的胞嘧啶鹼基編輯器 (derived cytosine base editors, DdCBEs)，它可以從粒線體中的 DNA 進行 C 到 T 的轉換。這是透過建立一種新的鹼基編輯技術，將單個核苷酸鹼基轉換為另一個鹼基而不破壞 DNA。然而，這種技術僅限於 C-to-T 轉換，而且主要限於 TC，使其成為有效的 TC-TT 轉換器。這意味著它只能修正 90 個中的 9 個( =10% )確認的致病性粒線體點突變。

TALED 能進行 DNA A-to-G 轉換

這篇公布於Cell研究的第一作者 Cho Sung-Ik 說：「為了克服這些限制，我們能夠建立了一個名為 TALED 的新型基因編輯平台，以實現 A-to-G 轉換。新平台擴大了粒線體基因編輯的範圍，不僅可以建立疾病模型，也可以為開發治療做出重大貢獻。」值得注意的是，僅能夠在人類 mtDNA 中進行 A 到 G 轉換就可以糾正 90 種已知致病突變中的 39 種（= 43%）。

研究人員融合三個不同的成分創造了 TALED。第一個成分是轉錄類活化因子效應遺傳因子 (transcription activator-like effector, TALE)，它能夠瞄準 DNA 序列。第二個成分是 TadA8e，一種促進 A 到 G 轉換的腺嘌呤去氨酶。第三個成分 DddAtox 是一種胞嘧啶去氨酶，它使 TadA8e 更容易接近 DNA。有趣的是研究團隊發現 TadA8e 能夠在具有雙股 DNA 的粒線體中進行 A 到 G 編輯，和過去所知 TadA8e 是一種僅對單股 DNA 具有特異性的蛋白質不同。Kim Jin-Soo表示，以前沒有人想過使用 TadA8e 對粒線體進行鹼基編輯，因為認為它應該只針對單股 DNA。這種跳出框架的思維模式，幫助拓展了新的領域。

研究人員推測，DddAtox 允許通過極短的時間窗口打開雙股，讓 TadA8e，這種快速酶進行必要的編輯。除了調整 TALED 的成分外，研究人員還開發了一種能夠同時進行 A-to-G 和 C-to-T 鹼基編輯以及僅 A-to-G 鹼基編輯的技術。他們透過建立包含所需粒線體 DNA（mtDNA）編輯的單細胞衍生複製，來展示這項新技術。此外，因 TALED 既沒有細胞毒性，也不會導致 mtDNA 不穩定，脫靶效應也很少，研究人員希望透過提高編輯效率和特異性來進一步改進 TALED，為胚胎、胎兒、新生兒或成年患者引起疾病的 mtDNA 突變，開創新的道路。

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參考資料：