好的载体带基因疗法上天堂！2 大类型如何选择？

基因疗法是用健康基因取代问题基因的一种现代医学技术，科学家们希望只需一剂注射来解决过去无法治疗的疾病，且数十年来，基因编辑工具的进步也让该领域突飞猛进，成为不少生技企业奋力角逐的新兴市场。

上一篇文章了解过基因疗法的缘起与起落后，接下来基因线上 GeneOnline 将解密基因疗法的不同载体特色与传递机制，让读者迅速理解基因疗法的面貌。

基因疗法仅限于编辑体细胞

依照传递及作用标的的不同，基因疗法可分成生殖细胞（germ cell）基因疗法和体细胞（somatic cell）基因疗法。前者将基因输送至卵子、精子等生殖细胞；后者将基因传递至骨髓、血液、皮肤细胞等体细胞。目前，所有基因疗法皆针对体细胞，这是因为编辑生殖细胞的基因会连同改变下一代人的基因体，而基于伦理道德考量，所以尚未有针对生殖细胞的基因疗法出现。

另一方面，体细胞基因疗法有 3 类，一是将基因传递至患者血液的活体（in vivo）疗法，二是在实验室编辑患者细胞的基因，再输送回人体的体外（ex vivo）疗法，最后则是直接让基因进入目标器官或组织的原位（in situ）疗法。

病毒载体：转染效率高、可标靶特定细胞

基因疗法采用病毒载体与非病毒载体等 2 种方式进行基因转移（gene transfer）。

病毒载体是使用病毒入侵人体与扩散的特性进行基因转移，但必须先去除病毒的自我复制机制与致病性，降低患者致病风险，即可作为该疗法的载体使用；而病毒的转导效率就决定了基因转移的功效。

病毒载体有嵌入型载体（integrating vectors）与非嵌入型载体 2 种，前者如反转录病毒（retrovirus）、慢病毒（lentivirus）可以嵌入患者 DNA，后者如腺病毒（adenovirus）、腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）、疱疹单纯型病毒（herpes simplex virus, HSV）则会成为游离 DNA（episomal DNA），保留在细胞核中。

而这 2 种载体的差别在于，游离载体不会在患者 DNA 中自行复制，也就是说，载体在细胞分裂后不会存在于子细胞，可在短时间内消失，这对追求转殖基因短期表现的疗法十分有用。

病毒载体中有 DNA 与 RNA 病毒之分。DNA 病毒载体已用于癌症、爱滋病、神经疾病、心血管疾病等多种临床候选药物中，举凡腺病毒、AAV、HSV；而像是慢病毒等 RNA 病毒载体则被用于暂时表现（transient expression）转殖基因，时下多用于爱滋病治疗的临床试验。

好用的病毒载体有哪些标准？

判定一个病毒载体是否优秀，可从载量、基因表现时效、组织趋向（能感染的细胞类型和数目）与转导效率来看。最重要的是，拥有低致病性与免疫原性，才不会在进入人体后引发严重的免疫反应。总体来说，AAV 病毒载体是目前主流的基因疗法传递方式。

美国 FDA 已核准 2 款 AAV 基因疗法，分别是 Novartis 治疗脊髓性肌肉萎缩症（spinal muscular atrophy）的 Zolgensma（AAV9）与 Spark Therapeutics 治疗莱伯氏先天性黑蒙症（leber congenital amaurosis）的 Luxturna（AAV2）。

此外还有多款 AAV 候选基因疗法正于第 2/3 期临床试验，譬如 Pfizer 治疗 A 型血友病的 SB-525（AAV6）、AskBio 治疗 B 型血友病的 AskBio 009（AAV8）、Takeda 治疗 A 型血友病的 TAK-754（AAV8）、Biogen 治疗脉络膜缺失症（choroideremia）的 timrepigene emparvovec（AAV2）、Homology Medicines 治疗苯丙酮尿症（phenylketonuria）的 HMI-102（AAVHSC15）等。

非病毒载体：安全性高、量产门槛低、便宜

制造非病毒载体以裸露质体 DNA（naked plasmid DNA）与微脂体（liposome）为大宗。它们因拥有低免疫原性，比病毒载体更安全，价格上也因量产门槛低，所以更便宜。然而非病毒载体的转染效率（transfection efficiency）并不高，且难以标靶特定细胞种类，同时也需大数量的载体才有办法达到治疗功效。

非病毒载体的基因传递机制

非病毒载体拥有多种传递方式。首先是微量注射（microinjection），这常用于制作基因转殖小鼠上，但因为质体在核酸内切酶血清（serum endonucleases）中会迅速降解，也容易受胞内体陷套（endosomal entrapment）与肾脏清除作用（renal clearance）破坏，所以微量注射并非传递质体 DNA 的最佳方式。

二来是雷射治疗、电穿孔（electroporation）与声孔作用（sonoporation），利用辐射、电场和高密度超声波，来增加标靶细胞的渗透性与摄取。第三是使用重金属传递裸露 DNA 的基因枪（gene gun），最后是使用电场能量传递 DNA 奈米粒子的磁转染系统（Magnetofection）。

基因编辑工具 CRISPR、ZFN、TALEN 的时代

基因编辑工具 ZFN、TALEN 与 CRISPR/Cas 的出现大幅增加了基因疗法的治疗范围，也让人类可直接编辑人体的基因缺陷。

相较传统基因疗法，CRISPR 不仅治疗成本低、精准度高，也拥有相对低的执行门槛，主要由 AAV 载体传递。研究人员可把 Cas9 酶和导引 RNA 放入 DNA 质体载体，再装入 AAV 即可使用；但 AAV 载体由于载量较低，所以仍有技术挑战要解决。

CRISPR 基因疗法还可将导引 RNA 放入能表现 Cas9 的细胞中进行传递，另外也有将 Cas9 的 N- 端与 C- 端放入 2 个 AAV 载体，并在转染细胞时组合成可正常运作的 Cas9 进行治疗。目前 CRISPR 基因疗法的最新传递方式是使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的小型 Cas9，这种方式较不占据 AAV 载体的空间。

CRISPR 常用于活体外基因疗法，举凡 CRISPR Therapeutics 与 Vertex Pharmaceuticals 透过编辑造血干细胞，共同开发的 β-地中海型贫血症与镰刀型红血球疾病（SCD）的 CRISPR 基因疗法 CTX001。

另一方面，CRISPR 在治疗杜氏肌肉萎缩症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）与遗传性高酪胺酸血症（hereditary tyrosinemia）上会采用静脉或针对特定组织注射的活体内治疗方式，例如史上第 1 个直接注射于人体的基因疗法，由 Editas Medicine 开发治疗莱伯氏先天性黑蒙症的 EDIT-101 就是一例。